متوسط

متحمل

*لاین‌های مربوط به دکتر برزگری، “لاین‌های مربوط به دکترآفرینش. رنگ‌های مشترک نشان دهنده یک شجره می‌باشد
۳-۲ مکان و زمان آزمایش
این تحقیق در سال ۱۳۹۳-۱۳۹۲ در دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان انجام شد.
۳-۳ استخراج DNA ژنومی
۳-۳-۳ ترکیبات بافر استخراج و ضرورت آنها
الف-[۱۱۳]CTAB وEDTA2 : شکستن دیواره‌ی سلول‌ها در طی مرحله استخراج[۱۱۴]توسط این دو ماده صورت می‌پذیرد. بافر CTAB سبب حذف غشای سلولی و مواد آبگریز موجود در محیط می‌شود. یون‌های دو ظرفیتی چون سبب حفظ یکپارچگی دیواره‌ی سلول‌های گیاهی می‌شوند، EDTA با کاتیون‌های دوظرفیتی Ca+2 و Mg+2 پیوند برقرار می‌کند که باعث بی‌ثباتی دیواره‌ی سلولی می‌شود. از سوی دیگر یون‌ها و فسفات‌های موجود در DNA به علت بار منفی و هم‌نام، یکدیگر را دفع می‌کنند)آیتکن و همکاران[۱۱۵]، ۲۰۰۸).
ب- NaCl: وجود NaCl در بافر به دلیل آزاد کردن Na+ و ایجاد پیوند یونی بین Na+ و P– سبب خنثی شدن بار منفی DNA و جمع شدن مولکول‌های آن در کنار هم می‌شود.
پ- مرکاپتواتانول[۱۱۶]: به عنوان یک آنتی‌اکسیدان عمل می‌کند و مسیر تخریب و جداسازی پروتئین‌ها را هموار می‌کندآیتکن و همکاران، ۲۰۰۸).
ت- کلروفرم- ایزوآمیل الکل[۱۱۷]: با اضافه کردن کلروفرم- ایزوآمیل الکل(۱:۲۴) پروتئین‌ها و لیپیدها از ماده‌ی وراثتی جدا می‌شوند.
ث- ایزوپروپانول[۱۱۸]: ایزوپروپانول سرد نیز سبب رسوب DNA می‌شود. به جای ایزوپروپانول می‌توان از دو برابر الکل ۹۵ درصد استفاده نمود.
ج-الکل۷۰ درصد و استات پتاسیم ۵ مولار: جهت حذف باقی‌مانده‌های ترکیبات فنولی و یون‌های معدنی استفاده می‌شوند و به عبارتی این دو ماده جهت شستوی نهایی بکار می‌روند.
۳-۳-۲ استخراج DNA
استخراج DNA از نمونه برگی به روش(CTAB) انجام شد که جزئیات آن به شرح زیر است:
استخراج DNA از نمونه‏های برگی به روش CTAB(جکسون و همکاران[۱۱۹]، ۱۹۹۹) انجام شد که جزئیات آن به شرح زیر است:
۱- ۲/۰ گرم از برگ(بدون رگبرگ) را وزن شده و به وسیله ازت مایع و با هاون چینی سرد شده پودر و به میکروتیوب ۵/۱ میلیلیتر منتقل گردید.
۲- سپس ۸۰۰ ماکرو لیتر از بافر استخراج CTAB جدول(۳-۲) که قبلا در بن ماری ۶۵ درجه به مدت ۱۰ دقیقه گرم شده، همراه با ۴۰ ماکرولیتر PVP و ۲ ماکرو لیتر مرکاپتواتانول اضافه شد (این عملیات باید در زیر هود انجام شود چون مرکاپتواتانول شدیدا سمی است).
۳- نمونه‌ها به مدت ۶۰ دقیقه در حمام بن ماری در دمایC°۶۵ درجه سانتی‌گراد قرار داده شد و در این مدت هر ۵ دقیقه به آرامی سر و ته شدند.
۴- بعد از خارج کردن نمونه‌ها ۱۰-۵ دقیقه به نمونه‌ها اجازه دادیم تا خنک شوند.
۶- به میزان ۵۰۰ ماکرولیتر کلروفورم ایزوآمیل الکل(۱:۲۴) سرد به میکروتیوپ‌ها اضافه شده و به آرامی به مدت ۳۰ دقیقه میکروتیوپ‌ها واژگون شدند.
۵- عمل سانتروفیوژ به مدت ۱۰ دقیفه در دور۱۳۰۰۰انجام شد.
۷- فاز رویی[۱۲۰] را با سمپلر کشیده شد و به میکروتیوب جدید منتقل شد.
۸- بسته به نیاز مرحله ۶ تا ۸ تکرار شد.
۹- برای رفع آلودگی RNA، مقدار ۱ میکرولیتر RNAase به هر میکروتیوب‌ها اضافه شده و به مدت ۱۵ دقیقه در حمام بن‏ماری قرار داده شدند.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۱۰- حجم ۶۰۰ میکرولیتر (هم‌حجم فاز رویی) ایزوپروپانول سرد به نمونه‌ها اضافه شده و به مدت ۳۰ دقیقه در دمایC°۲۰- قرار داده شدند.
۱۱- به منظور شتشو ۲۰۰ ماکرولیتراتانول ۷۰ درصد و ۲۰۰ ماکرولیتر استات آمونیوم ۵ مولار به نمونه‌ها اضافه شده و به مدت ۲۰ دقیقه در دمای اتاق نگهداری شدند.
۱۲- مرحله ۷ تکرار شد.
۱۳- رسوب به دست آمده به مدت ۱۵ دقیقه در هوای اتاق خشک شد.
۱۴- بسته به میزان رسوب DNA مشاهده شده، ۲۰۰ -۵۰ مایکرولیتر آب مقطر یا TE به نمونه‌‌ها اضافه شدند.
۱۵- نمونه‌های DNA استخراج شده ابتدا تا حل شدن کامل به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری و سپس به فریزر۲۰- منتقل شدند.
برای استخراج DNA ژنومی از روش CTAB تغییر یافته استفاده شد (جدول ۳-۲).
جدول ۳-۲ ترکیبات بافر استخراج CTAB

غلظت

مواد شیمیایی

۱۰۰ میلی‌مولار

Tris-HCl (pH=8)

۲۰ میلی‌مولار

Na2EDTA (pH=8)

۴/۱ ‌مولار

NaCl

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...