شکل ۴-۱۲- طیف­های فلورسانس مربوط به آنزیم TTL انکوبه شده در مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون PF₆؛
پس از ۶۰ دقیقه حرارت­دهی در دمای°C 85

شکل ۴-۱۳- طیف فلورسانس آنزیم TTL انکوبه شده در مایع یونی [C₄MIM][PF₆]؛
پس از حرارت­دهی در دمای°C 85.
فصل پنجم
بحث
۵-۱- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL
با به کارگیری مایعات یونی بر پایه ایمیدازولیوم در فرآیندهای بیوکاتالیزوری می­توان فعالیت، اختصاصیت و پایداری آنزیم­ها را ارتقا داد (Wehofsky et al.,2008، Debnath et al.,2010). مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون برمید حلالیت خوبی در آب دارند. کارهای متعددی در زمینه بررسی اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت آنزیم لیپاز در انجام واکنش­های استریفیکاسیون، ترانس استریفیکاسیون و تفکیک مخلوط­های راسمیک انجام شده است(Liu et al.,2010 ،Kaar et al., 2003 ،Lozano et al., 2004 ، Vidya and Chadha, 2009 ،Habulin and Knez,2009 ). با این وجود گزارشات محدودی از بررسی اثر مایعات یونی بر میزان فعالیت هیدرولازی آنزیم لیپاز وجود دارد (Ventura et al., 2012 ، Na et al.,2013 ).
می­توان اثر غلظت­های مختلف و ساختار کاتیون مایع یونی بر فعالیت هیدرولازی TTL را بر اساس خصوصیات تفکیک یونی و تجمع مایعات یونی تفسیر کرد. با توجه به گزارش Na و همکاران با افزایش غلظت مایعات یونی [C_nMIM][Br] رسانایی محلول نیز افزایش می­یابد (Na et al.,2013). به گزارش Sirieix-Plenet و همکاران در غلظت­های­ کمتر از غلظت آستانه تشکیل میسل در مایع یونی، افزایش غلظت مایعات یونی با افزایش رسانایی محلول در ارتباط است و پس از این غلظت این رابطه دیده نمی­ شود (Sirieix-Plenet et al., 2004) پس بر اساس این مشاهدات می­توان غلظت آستانه تشکیل میسل را به دست آورد. غلظت­های آستانه تشکیل میسل و همچنین غلظت­های بهینه مایعات یونی برای فعالیت آنزیمی حاصل از پژوهش حاضر در جدول ۵-۱ آمده است. غلظت­های بهینه به دست آمده برای افزایش فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی در مورد [C₂MIM][Br] و [C₆MIM][Br] کمتر ازCMC های گزارش شده برای این مایعات یونی است و در مورد مایع یونی [C₄MIM][Br] نیز غلظت بهینه در نزدیکی CMC مربوطه قرار دارد. بنابراین تا زمانی که غلظت مایعات یونی کمتر از مقادیر CMC مربوطه است، مایعات یونی می­توانند باعث افزایش فعالیت آنزیمی شوند. با افزایش غلظت مایع یونی از میزان CMC مربوطه مهار فعالیت آنزیمی را می­توان مشاهده کرد.

جدول ۵-۱- غلظت­های بهینه مایعات یونی (C_nMIM Br n=2,4,6) و CMC های مربوطه

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

مایعات یونی
غلظت بهینه (mM)
CMC (mM)

[C₂MIM][Br]

۳۰۰

۱۹۰۰ (Goodchild I., 2007)

[C₄MIM][Br]

۱۰۰۰

۹۷۰ (Wang J. J., 2007)

[C₆MIM][Br]

۳۰۰

۷۷۰ (Wang J. J., 2007)

مطالعات اندکی در رابطه با بررسی اثر تجمع مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی انجام شده است. در این رابطه می­توان مطالعه­ ای توسط Geng را نام برد که ساختار پروتئین ^[۹۶]BSA را در کنار غلظت­های مختلف مایعات یونی مورد بررسی قرار داده است (Geng et al., 2010). نتایج نشان می­دهد که در غلظت­های کمتر از CMC مایعات یونی برهم­کنش­های الکتروستاتیک با BSA برقرار می­ کنند و باعث پایدار شدن ساختار دوم BSA می­شوند. درحالی­که در غلظت­های بالاتر از CMC شدت آبگریزی مایعات یونی افزایش یافته و با اتصال قوی­ به BSA ساختار دوم آن­را برهم می­زنند و باعث دناتوره شدن BSA می­شوند. بنابراین می­توان گفت زمانی که غلظت مایع یونی بالاتر از CMC برود تعداد آنزیم­هایی که درون میسل­ها به دام می­افتند افزایش یافته و بنابر این آنزیم­ های بیشتری غیرفعال خواهند شد. در رابطه با مایعات یونی که در این پژوهش مورد بررسی قرار گرفت، افزایش فعالیت هیدرولازی را می­توان بر اساس برهم­کنش­های هیدروژنی و الکتروستاتیک ایجاد شده بین آنزیم و مایعات یونی آبدوست توضیح داد. این نوع برهم­کنش­ها می­توانند باعث باز شدن نسبی جایگاه فعال آنزیم و در نتیجه دسترسی بیشتر سوبسترا به محل وقوع واکنش شوند. هرچند این مایعات یونی به دلیل اندازه بزرگ کاتیون­ها، فضای محدودی در اطراف آنزیم ایجاد می­ کنند که مانع از باز شدن کامل ساختار آنزیم می­شوند. بنابراین در عین افزایش فعالیت آنزیمی در غلظت بهینه مایعات یونی آبدوست، پایداری ساختاری آنزیم نیز در این مایعات یونی حفظ می­ شود. نتایج نشان داد که کاهش فعالیت هیدرولازی TTL در غلظت­های بالاتری از مایعات یونی دارای زنجیره کوتاه­تر کربنی مانند [C₂MIM][Br] و [C₄MIM][Br]، ایجاد می­ شود. در حالی­که در مورد مایعات یونی با زنجیره کربنی بلندتر مانند [C₆MIM][Br]، این کاهش بلافاصله پس از گذشتن از غلظت بهینه اتفاق می­افتد. کاتیون­های دارای زنجیره کربنی طویل می­توانند با ایجاد ممانعت فضایی در دهانه جایگاه فعال آنزیم که یک فضای آبگریز است، مانع از ورود سوبسترا و انجام واکنش شوند. این پدیده می ­تواند دلیلی برای کاهش فعالیت آنزیم در اثر افزایش غلظت مایعات یونی با طول زنجیره­های بلندتر باشد (Ventura et al., 2012).
شایان ذکر است که گزارشات موجود در مورد مایعات یونی دارای آنیون برمید غالبا اثر منفی این نوع از مایعات یونی را بر فعالیت و ساختار آنزیم نشان داده­اند. نوریتومی و همکاران درصد بسیار پائینی از فعالیت آنزیم لیزوزیم را در حضور مایع یونی [C₂MIM][Br] نسبت به محیط بافری و مایعات یونی آبگریز گزارش دادند (Noritomi et al., 2011). ساسمال و همکاران [C₅MIM][Br] را یک عامل دناتوره کننده برای پروتئین HSA^[97] دانستند (Sasmal et al., 2011). یان و همکاران تعداد زیاد برهم­کنش­های الکتروستاتیک بین مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون برمید و آمینواسیدهای آسپارتات و گلوتامات پروتئین BSA را علت باز شدن ساختار BSA گزارش دادند (Yan et al., 2012). این در حالی است که در چنین مطالعاتی اثر غلظت مایعات یونی را بررسی نشده است. مطالعاتی توسط Na در سال ۲۰۱۳ و هم­چنین Zhao در سال ۲۰۰۶ از معدود مواردی هستند که این موضوع را مورد توجه قرار داده­اند. در این بخش از پژوهش نشان داده شد که مایعات یونی با آنیون برمید نیز می­توانند در غلظت­های خاصی اثرات مطلوب قابل توجهی بر فعالیت آنزیمی داشته باشند.
۵-۲- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL
یکی از شرایط اصلی که می­بایست برای بهینه سازی انجام یک فرایند صنعتی مورد بررسی قرار داد، میزان پایداری آنزیم در شرایط محیطی خاص در دماهای بالا است. مایعات یونی به عنوان محیط واکنش مناسب در فرآیندهای صنعتی بسیار مورد توجه قرار گرفته­اند. پایداری دمایی آنزیم در محیط­های حاوی مایعات یونی یک شرط مهم برای استفاده از این محیط­ها در فرآیندهای صنعتی می­باشد. در این بخش از پژوهش ابتدا پایداری دمایی آنزیم در محیط آبی و سپس در مخلوط­های آبی مایعات یونی مختلف مورد بررسی قرار گرفت.
بررسی غیرفعال شدن برگشت­پذیر آنزیم لیپاز در دماهای بالا در مایعات یونی [C₄MIM][Br] (غلظت ۱ مولار) و [C₄MIM][PF₆] نشان داد که به طور کلی مایعات یونی ایمیدازولیومی با هر کدام از آنیون­های آبدوست و آبگریز، نسبت به محیط­های بافری محیط بهتری را برای حفظ پایداری آنزیم فراهم می­ کنند. هر چند مایعات یونی آبگریز مانند مایع یونی [C₄MIM][PF₆] نسبت به مایعات یونی آبدوست مانند [C₄MIM][Br]، که در این بخش مورد بررسی قرار گرفت، محیط پایدارکننده بهتری را برای آنزیم TTL ایجاد می­ کنند.
این باور وجود دارد که حلال­های آلی آبدوست با جذب آب اطراف ملکول آنزیم به سمت خود، باعث باز شدن آنزیم و در معرض قرارگیری باقیمانده­های آبگریز درون ساختار پروتئین می­شوند (Zaks and Klibanov, 1988). مایعات یونی نیز به طور کلی جزء حلال­های آبدوست و نسبتا قطبی به حساب می­آیند. با این وجود نتایج به دست آمده از این پژوهش و همچنین مطالعات دیگر (Liu et al., 2011, Dang et al., 2007, Pan et al., 2010, Ventura et al., 2012) نشان می­دهد که مایعات یونی خصوصا مایعات یونی با کاتیون ایمیدازولیوم هرچند با آنیون­های آبدوست می­توانند در غلظت­های کم باعث پایداری و حفظ ساختار آنزیم شوند. این امر احتمالا به دلیل ایجاد شبکه­ هایی از مایعات یونی است که به واسطه کاتیون­های بزرگ شامل زنجیره­های کربنی آن­ها ایجاد می­شودو باعث حفظ آنزیم در ساختار طبیعی خود و کاهش انعطاف­پذیری ساختار آن در طی زمان دمادهی به آنزیم می­شوند. هم­چنین می­توان افزایش پایداری آنزیم در حضور این مایعات یونی را به تغییرات احتمالی ساختار دوم آنزیم لیپاز مرتبط دانست که در مطالعات ساختاری گذشته نشان داده شده است. در پژوهشی توسط De Diego و همکاران ایجاد ساختار فشرده در آنزیم همراه با افزایش تعداد α-helix و β-sheet یکی از شواهد پایدار شدن آنزیم در محیط مایعات یونی گزارش شد(De Diego et al., 2005).
نمودار پایداری دمایی آنزیم TTL در مایع یونی [C₄MIM][PF₆] نیز نشان می­دهد که در هر دو دمای °C85 و °C90 این نوع مایع یونی به شدت پایداری آنزیم را حفظ می­ کند. همان­طور که در گزارشات پیش از این نیز دیده می­ شود (Paljevac et al., 2006) طبیعت آبگریز مایع یونی [C₄MIM][PF₆]، که بیشتر هم به دلیل حضور یون PF₆^– است، می ­تواند سبب پایدارسازی آنزیم­ها شود. این قابلیت بالا احتمالا به دلیل توانایی این مایع یونی در حفظ ملکول­های آب ضروری در محیط پیرامون آنزیم است (Lozano et al., 2005).
همان­طور که گفته شد، مایعات یونی با کاتیون ایمیدازولیوم سبب افزایش پایداری آنزیم TTL می­شوند. این مایعات یونی بسته به نوع آنیونی که در ساختار خود دارند، شدت اثر پایدارکنندگی متفاوتی را از خود نشان می­ دهند. در مقایسه­ ای که در این پژوهش مقایسه­ ای بین مایعات یونی [C₄MIM][PF₆] و [C₄MIM][Br] در دماهای بالا (°C 85 و °C 90) انجام شد، مایع یونی دارای آنیون PF₆^– اثر پایدارکننده بیشتری را برای آنزیم TTL ایجاد کرد.
نوع برهم­کنش­های بین آنیون مایعات یونی و آنزیم می ­تواند شاهد خوبی برای تفسیر علت پایداری بیشتر آنزیم در [C₄MIM][PF₆] باشد. برهم­کنش­های مختلفی که ممکن است بین آنیون­ها و آنزیم برقرار شود، توسط گروه ­های مختلفی براساس پارامترهای سولواتوکرومیک و همچنین قطبیت، اندازه و توزیع بار در زنجیره جانبی آمینواسیدها مورد بررسی قرار گرفته است (Tome et al., 2008). گزارشات مختلفی مبنی بر اثر نوع آنیون بر پایداری آنزیم در مایعات یونی وجود دارد. دسته ای از این مطالعات نحوه اثر آنیون­ها را بر اساس جایگاه قرارگیری آن­ها در سری هافمیستر توضیح داده­اند. سری هافمیستر(شکل ۵-۱) در واقع نوعی دسته بندی یون­ها بر اساس قابلیت آن­ها در حل کردن و رسوب دادن پروتئین است (Hofmeister F.,1888). به صورت زیر (Zhao et al., 2006):
اثر آنیون­ها بر اساس این سری بیشتر از کاتیون­ها است. در پژوهشی توسط Kumar مایعات یونی دارای آنیون کاسموتروپ و کاتیون کائوتروپ بر اساس سری هافمیستر گزینه های مناسبی برای پایدار ماندن آنزیم­ها پیشنهاد شدند (Kumar et al. 2014). هرچند سری هافمیستر در برخی موارد صدق نمی­کند. برای مثال در مورد آنیون PF₆^– گزارشات مختلفی مبنی بر افزایش پایداری آنزیم­ها در مایعات یونی دارای این آنیون وجود دارد. از این جمله می­توان پژوهش Ha و همکاران را نام برد که پایداری دمایی بسیار خوبی از آنزیم CALB را در حضور مایعات یونی با آنیون PF₆^– دیدند (Ha et al., 2008). این در حالی است که جایگاه این آنیون در سری هافمیستر در دسته آنیون­های کائوتروپ و ناپایدارکننده است. در تفسیر چگونگی اثر این آنیون بر پایداری آنزیم، Klahn با بررسی حلالیت آنزیم CALB در ۸ نوع مایع یونی مختلف، علت پایداری بیش­تر آنزیم در مایعات یونی دارای آنیون PF₆^– را آبگریزی بالای این آنیون دانست (Klahn et al., 2011). آنیون­های آبگریز مانند PF₆^– با آنزیم پیوند هیدروژنی برقرار نمی­کنند و ملکول­های آب ضروری اطراف آنزیم را حفظ می­ کنند. بنابراین آسیبی به ساختار طبیعی آنزیم نمی­زنند. همچنین در بین آنیون­ها، آنیون­هایی با اندازه کوچک­تر و چگالی بار سطحی بیش­تر، به تعداد بیشتری در سظح آنزیم تجمع می­یابند و بر هم­کنش­های الکتروستاتیک قوی­تری با بارهای سطحی آنزیم برقرار می­ کنند. در این حالت احتمال باز شدن ساختار طبیعی آنزیم به دلیل تعداد بیش­تر برهم­کنش­ها با حلال افزایش می­یابد. چنین پدیده­ای را در مورد مایعات یونی دارای آنیون برمید یا کلرید می­توان دید. به طور متقابل آنیون­های بزرگی مانند PF₆^– که چگالی بار سطحی کمی دارند، توانایی ایجاد تعداد کمتری برهم­کنش الکتروستاتیک با سطح آنزیم دارند. بنابراین کمتر ساختار آنزیم را تحت تاثیر قرار می­ دهند. با این حال حفظ پایداری آنزیم در چنین محیط­هایی همواره با مشکل حل نشدن آنزیم در مایعات یونی آبگریز همراه بوده است (Klahn et al., 2011). حفظ پایداری آنزیم در مایع یونی [C₄MIM][PF₆] در دماهای بالا پیش از این نیز گزارش شده است (Ha et al., 2008) که با نتایج گزارش شده از پژوهش حاضر مطابقت دارد.
بر اساس نتایج حاصل از بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در مایعات یونی ایمیدازولیومی با طول­های مختلف زنجیره کربنی، مایعات یونی با زنجیره­های ۲، ۴ و ۶ کربنه عملکرد نسبتا مشابهی را در حفظ پایداری آنزیم از خود نشان می­ دهند. اختلاف زیاد فعالیت باقیمانده آنزیم پس از دمادهی در محیط مایعات یونی نسبت به محیط بافری نشان دهنده اثر بسیار مطلوب مایعات یونی در حفظ پایداری آنزیم است که دلایل احتمالی این اثر پیش از این گفته شد. در این میان [C₆MIM][Br] با اختلاف کمی نسبت به [C₂MIM][Br] و [C₄MIM][Br]، محیط مناسب­تری را برای حفظ پایداری آنزیم فراهم می­ کند.
با مقایسه پایداری آنزیم در این مایعات یونی می­توان دریافت که طول زنجیره کاتیونی اثر کمی در میزان اختلاف پایداری آنزیم در این محیط­ها دارد. هرچند طول­های بسیار بالای زنجیره کاتیونی مایعات یونی ایمیدازولیومی اثر منفی بر پایداری ساختار آنزیم می­گذارند. مایعات یونی که در کاتیون خود زنجیره آلکیلی بلند دارند، در محیط آبی مانند سورفاکتانت عمل می­ کنند و بر فعالیت و پایداری آنزیم به شدت اثر می­گذارند (Greaves et al., 2008, Tariq et al., 2012). گزارشات متعددی مبنی بر اثر طول زنجیره مایعات یونی بر پایداری و فعالیت آنزیم­ها وجود دارد. Attri و همکاران دریافتند که مایعات یونی با کاتیون ایمیدازولیوم و فسفونیوم هرچقدر زنجیره آلکیل بلندتر و در نتیجه آبگریزی بیشتری داشته باشند عامل پایدارکننده ضعیف­تری برای α-کیموتریپسین به حساب می­آیند (Attri et al., 2011).
همان­طور که در بخش ۴-۶-۲-۳ نشان داده شد، با تغییر نوع کاتیون از پایه ایمیدازولیوم به پایه پیریدینیوم تغییر زیادی در میزان پایداری دیده نمی­ شود. مایع یونی [C₅Py][Br] نیز مانند مایعات یونی ایمیدازولیومی با طول مشابه ([C₄MIM][Br] و [C₆MIM][Br]) باعث حفط پایداری آنزیم در حدود ۶۰ درصد طی یک ساعت دمادهی در دمای °C85 می­ شود. همچنین مایع یونی [C₁₂Py][Br] به طور مشابهی نسبت به مایع یونی متناظر ایمیدازولیومی ([C₁₂MIM][Br]) هیچ اثر مطلوبی بر پایداری دمایی آنزیم نداشته است. در این مورد Yamamoto و همکاران مشاهده کردند که افزایش طول زنجیره کربنی در مایع یونی [C_nPy][Br] باعث ناپایدار شدن آنزیم لیزوزیم می­ شود (Yamamoto et al., 2011). علت احتمالی این پدیده ایجاد برهم­کنش­های آبگریز قوی بین آنزیم و زنجیره بزرگ کاتیونی آبگریز مایع یونی گزارش شده است.
۵-۳- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور مایعات یونی
اسپکتروسکوپی فلورسانس یک ابزار مرسوم برای بررسی تغییرات کنفورماسیون پروتئین است. در این بخش از پژوهش جهت ایجاد درک بهتر از مکانیسم پایدارسازی آنزیم توسط مایعات یونی از تکنیک فلورسانس جهت بررسی ساختار آنزیم TTL، پس از مجاورت با مایعات یونی مختلف در دمای °C85 و سرد سازی در یخ، استفاده شد.
آنزیم TTL داری دو آمینواسید تریپتوفان در ساختار خود می­باشد که در این روش میزان نشر فلورسانس این آمینواسید پس از برانگیخته شدن در طول موج nm 295، مورد بررسی قرار گرفت. بیشینه میزان شدت فلورسانس (I_Max) و بیشینه طول موج نشر (λ_Max)، تغییرات کنفورماسیون آنزیم را در حضور مایعات یونی مختلف و در عدم حضور مایع یونی نشان می­دهد (Bekhouche M., 2012). زمانی که ساختار آنزیم باز شود این باقیمانده­های کروموفور در معرض حلال آبدوست قرار می­گیرند و در نتیجه شدت نشر فلورسانس آن­ها با قرارگیری در فضای آبدوست کاهش می­یابد. البته این امر می ­تواند به دلیل پوشانده شدن عوامل فلوروفور پروتئین (Trp) توسط یون­های مایع یونی نیز باشد.
کاهش شدید نشر فلورسانس پروتئین به سبب باز شدن ساختار دوم پروتئین و قرارگیری باقیمانده های Trp در معرض حلال آبدوست مشاهده می­ شود. چنین پدیده ای در اثر حرارت دهی به آنزیم TTL در محیط بافری دیده شد. همان­طور که در بخش ۴-۶-۲ این پژوهش نیز نشان داده شد، آنزیم TTL در فضای بافری در دمای ˚C 85 پایدار نیست و در اثر حرارت دهی ساختار آنزیم باز شده و با قرارگیری باقیمانده های Trp در معرض حلال آبدوست، کاهش نشر فلورسانس را سبب خواهد شد.
طیف های نشری فلورسانس آنزیم TTL پس از انکوباسیون آنزیم در مایعات یونی[C₄MIM][PF₆] و [C₆MIM][PF₆] و سپس خارج کردن آنزیم از این محیط و وارد کردن آن به فضای آبی، گرفته شدند. بالا بودن شدت نشر فلورسانس در مورد آنزیم انکوبه شده در [C₄MIM][PF₆] نشان دهنده حفظ فشردگی ساختاری TTL در این محیط، حتی پس از ۱ ساعت حرارت دهی در ˚C 85 است. شدت نشر فلورسانس مربوط به [C₆MIM][PF₆] پایین­تر از [C₄MIM][PF₆] است. هرچند، کاهش λ_Max در مورد محیط [C₆MIM][PF₆] را می توان به فشرده­تر شدن ساختار پروتئین در این محیط که آبگریز­تر و دارای گرانروی بالاتری نسبت به [C₄MIM][PF₆] است، مرتبط دانست.
بنابراین با توجه به مشاهدات ساختاری بر اساس طیف های فلورسانس و بررسی های سینتیکی فعالیت آنزیمی در حضور این مایعات یونی می توان گفت آنزیم TTL در محیط [C₄MIM][PF₆] پایداری دمایی بیش­تری هم از نظر ساختاری و هم از نظر حفظ فعالیت سینتیکی را داشته است.
بررسی ساختار TTL در محیط [C₄MIM][PF₆] در زمان های مختلف حرارت دهی نشان می­دهد که آنزیم تا حد زیادی ساختار خود را حفظ کرده است. کاهش اندک نشر فلورسانس پس از ۳۰ و ۶۰ دقیقه حرارت دهی در ˚C 85 گویای حفظ باقیمانده های Trp در جایگاه درون ساختاری خود می­باشند. همچنین تفاوت زیاد موجود در بیشینه نشر فلورسانس مربوط به آنزیم حرارت داده شده در ˚C 85، نسبت به آنزیم کاملا غیرفعال (۲ ساعت حرارت دهی در ˚C100 در بافر تریس mM 50)، بیانگر حفظ پیچیدگی ساختاری در محیط این مایع یونی است. علت این امر همان­طور که پیش از این نیز در بخش سینتیکی گفته شد آبگریزی بالای مایع یونی است که سبب حفظ آب ضروری اطراف آنزیم می شود. همچنین بزرگی ملکول­های این نوع مایعات یونی سبب تشکیل ساختارهای شبکه مانندی می شود که انعطاف­پذیری ملکول آنزیم را کم کرده و در هنگام افزایش دمای محیط مانع از باز شدن ساختار آنزیم و دناتوره شدن پروتئین می­ شود.
فصل ششم
نتیجه گیری و پیشنهادات