۵/۶۲ µg/ml

۱۲۵ µg/ml

۲۵۰ µg/ml

۵۰۰ µg/ml

۱۰۰۰ µg/ml

۲۰۰۰ µg/ml

۴۰۰۰
µg/ml

نانو ذرات نقره

جهت کنترل مثبت در یکی از چاهک­ها از محیط کشت و سوسپانسیون میکروبی ریخته شد و برای کنترل منفی در چاهک دیگر محیط کشت و عصاره/ اسانس و نانو ذرات نقره ریخته شد. برای جلوگیری از خشک شدن مواد داخل میکروپلیت درب آن بسته شد و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد انکوبه شد.

( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

مقدار MIC عبارت است از حداقل غلظتی که قادر است از رشد قابل مشاهده ارگانیسم جلوگیری کند و آنتی­بیوتیک­هایی که غلظت درمانی در این حد ایجاد کنند باکتریواستاتیک نام دارند، که بوسیله چشم غیر مسلح هم قابل مشاهده است. با مقایسه چاهک­ها با خانه کنترل مثبت و کنترل منفی می­توان رشد یا عدم رشد باکتری را مشاهده کرد. آخرین چاهک که در آن رشدی مشاهده نمی­گردد به عنوان MIC در نظر گرفته می­ شود.
۳-۲-۱۸- بررسی حداقل غلظت کشنده باکتری (MBC)
مقدار ^[۴۶]MBC عبارتست از حداقل غلظتی از دارو که قادر است ۹۹% از باکتری­ ها را از بین ببرد. برای تعیین MBC از هر یک از چاهک­های میکروپلیت که رشد باکتری در آن­ها دیده نشده است به میزان ۱۰ میکرولیتر برداشته و در محیط جامد مولر هینتون آگار کشت و به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور قرار داده شد و غلظتی که در آن هیچ کلنی از میکرو­ارگانیسم رشد نکرده بود به عنوان MBC گزارش گردید.
کلیه مراحل فوق در کنار شعله انجام شد و هر تست ۳ بار تکرار و نتایج حاصله ثبت گردید.
۳-۲-۱۹- آزمون Check board microtiter
این آزمون یک روش مرسوم جهت تعیین MIC داروهای ضد میکروبی در ترکیب می­باشد. جهت این انجام این آزمون از میکروپلیت ۹۶ خانه استریل استفاده شد. ابتدا تمام رقت­های نانو ذرات نقره، عصاره و اسانس آویشن شیرازی که قبلاً نحوه آماده سازی آن توضیح داده شده، آماده گردید. سپس Lµ ۵۰ از سریال رقت‌های نانو ذرات نقره در ردیف­های افقی در چاهک­ها ریخته شد. سپس Lµ ۵۰ از سریال رقت­های عصاره/اسانس گیاه در ردیف­های عمودی چاهک اضافه شد.
در ترکیب نانو ذرات نقره و عصاره گیاه آویشن شیرازی در اولین چاهک ردیف افقی غلظت نانو ذرات نقره µg/ml 8000 و در آخرین چاهک ردیف افقی غلظت µg/ml 625/15 می­باشد و غلظت عصاره آویشن شیرازی در اولین چاهک عمودی غلظت mg/ml100 و در آخرین چاهک ردیف عمودی غلظت mg/ml78/0 می­باشد. در ترکیب نانو ذرات نقره و اسانس آویشن شیرازی نیز به همین صورت می­باشد. به این ترتیب غلظت ترکیب مورد نظر ما در اولین ردیف عمودی/افقی دارای بیشترین غلظت و در آخرین چاهک عمودی/افقی دارای کمترین غلظت می­باشد. در نهایت Lµ ۱۰۰ از سوسپانسون میکروبی معادل نیم مک فارلند در تمام چاهک اضافه شد. به عنوان شاهد از رقت­های نانو ذرات نقره و عصاره/ اسانس گیاه آویشن شیرازی جهت کنترل در چاهک­های دیگر به تنهایی ریخته شد. سپس به مدت ۳ تا ۵ دقیقه روی شیکر قرار داده و سپس میکروپلیت در داخل انکوباتور ۳۷ درجه سانتی ­گراد به مدت ۲۴ ساعت گرما گذاری شد و سپس مورد بررسی قرار گرفت و به عنوان MIC ترکیب نانو ذرات نقره و عصاره/ اسانس آویشن شیرازی در نظر گرفته شد.
۳-۲-۲۰- تعیین FIC ترکیب نانو ذرات نقره و عصاره/اسانس گیاه آویشن شیرازی
جهت تعیین اثر تداخلی ترکیب یا تعیین مقدار FIC^[47] (غلطت بازدارندگی جزئی) ابتدا مقدار MIC نانو ذرات نقره در ترکیب با عصاره/اسانس آویشن شیرازی همانطور که قبلاً توضیح داده شد، تعیین گردید و همچنین مقدار MIC عصاره و اسانس آویشن شیرازی در ترکیب با نانو ذرات نقره تعیین شد، سپس طبق فرمول­های زیر محاسبه شد. سپس مقدار FICI^[48] یا FIC کل نیز طبق فرمول محاسبه گردید.
چنانچه مقدار FICI کمتراز ۵/۰ باشد اثر سینرژیستی است، بین ۵/۰ و ۱ باشد هم افزایی نسبی دارد و اگر مقدار آن بین ۱ و ۴ باشد بی اثر است و اگر بیش از ۴ باشد آنتاگونیست می­باشد.
FICI≤ ۰.۵: Synergistic 0.5> FICI≤۱.۰: Additive
۱>FICI≤۴: Indifferent > 4: Antagonistic FICI
۳-۲-۲۱- معتبر سازی آزمایشات
۱- کنترل کیفی عصاره، اسانس، نانو ذرات نقره و حلال آن­ها از نظر آلوده نبودن، از طریق کشت آن­ها در محیط مولر هینتون براث. بدین منظور Lµ۱۰۰ از هر کدام، در Lµ۱۰۰محیط کشت مولر هینتون براث ریخته شد و ۲۴ ساعت در ۳۷ درجه سانتی ­گراد انکوبه شد. پس از طی این مدت زمان چنانچه هیچ کدورتی مشاهده نگردد به منزله عدم آلودگی می­باشد.
۲- استفاده از کنترل منفی در روش چاهک پلیت. به این صورت که در یکی از چاهک­ها از حلال­های مورد نظر ریخته شد. در صورتی که هاله عدم رشد ایجاد نشود، به این معنی است که حلال مورد نظر فاقد خاصیت ضد میکروبی می­باشد.
۳-استفاده از کنترل منفی در روش تعیین MIC. به این صورت که در یکی ازچاهک­های میکروپلیت فقط از عصاره، اسانس و یا نانو ریخته شد و در چاهک بعدی فقط محیط کشت مولر هینتون براث ریخته شد. در هیچ کدام از این چاهک­ها نباید کدورتی مشاهده شود.
۴-استفاده از کنترل مثبت رشد در روش تعیین MIC. در یکی از چاهک­های میکروپلیت فقط از مجموعه محیط کشت و سوسپانسیون میکروبی ریخته شد. کدورت بوجود آمده در این چاهک می ­تواند مقیاسی جهت بررسی تمام چاهک­ها از نظر کدورت باشد.
۵-استفاده از آنتی­بیوتیک استاندارد که به عنوان کنترل کار، همزمان در یکی از چاهک­ها در روش چاهک پلیت و در یکی از چاهک­های میکروپلیت در تعیینMIC فقط از سوسپانسیون آنتی­بیوتیک ریخته شد.
فصل چهارم
نتایج
۴-۱- نتایج اثرات ضد باکتریایی عصاره، اسانس و نانو ذرات نقره
در پژوهش حاضر اثر ضد میکروبی عصاره و اسانس آویشن شیرازی و همچنین نانو ذرات نقره بر روی ۵ باکتری استاف اورئوس حساس و مقاوم به متی­سیلین، استاف اپیدرمیدیس، استرپتوکوک پیوژنز و سودوموناس آئروژینوزا مورد آزمایش قرار گرفت.
در بررسی اثر ضد باکتریایی عصاره گیاه آویشن شیرازی ۸ غلظت متفاوت در نظر گرفته شد. در جدول ۴-۱ میانگین قطر هاله عدم رشد غلظت­های مختلف عصاره آویشن شیرازی بر بروی این ۵ باکتری آورده شده است. همچنان که مشاهده می­ شود، بالاترین غلظت عصاره گیاه یعنی mg/ml 100 بیشترین اثر ضد میکروبی را دارد و پایین­ترین غلظت عصاره گیاه که اثر باکتری کشی دارد، در باکتری استاف اورئوس mg/ml125/3، در باکتری MRSA نیز mg/ml125/3، در باکتری استاف اپیدرمیدیس mg/ml56/1، در باکتری استرپ پیوژنز mg/ml 78/0 و در باکتری سودوموناس آئروژینوزا mg/ml5/12 می­باشد.
در بررسی اثر ضد باکتریایی اسانس گیاه آویشن شیرازی نیز ۸ غلظت آماده شد. بالاترین غلظتی از اسانس که تهیه شد mg/ml200 می­باشد. همانطور که در جدول ۴-۲ آمده است، در بالاترین غلظت اسانس در هر ۵ باکتری هاله عدم رشد مشاهده می­گردد. پایین­ترین غلظت اسانس که اثر ضد باکتریایی دارد، در ۳ باکتری استاف اورئوس، MRSA و استاف اپیدرمیدیس mg/ml 25/6، در باکتری استرپتوکوک پیوژنز mg/ml56/1 و در باکتری سودوموناس آئروژینوزا mg/ml 25 می­باشد.
در بررسی اثر ضد باکتریایی نانو ذرات نقره از محلول کلوئید نانو ذرات نقره شرکت نانو لوتوس پاسارگاد استفاده شد. ۸ غلظت متفاوت از آن برای تعیین قطر هاله عدم رشد تهیه گردید. همانطور که در جدول ۴-۳ مشاهده می­گردد در بالاترین غلظت محلول نانو ذرات نقره µg/ml 8000 بالاترین قطر هاله عدم رشد مشاهده می­گردد و در پایین­ترین غلظت آن µg/ml 5/62 کمترین قطر هاله عدم رشد مشاهده می­گردد.
جدول۴-۱- نتایج قطر هاله عدم رشدعصاره آویشن شیرازی بر روی ۵ باکتری مورد آزمایش

باکتری

غلظت

میانگین قطر هاله عدم رشد (میلیمتر)

انحراف استاندارد
(میلیمتر)

p-value

معنی داری

S. aureus

۱۰۰

۲۹.۳۳

۱

۰.۰۰۲