محیط TSI آگار حاوی تیوسولفات سدیم نیز می باشد و به عنوان سوبسترا در بررسی توانایی تولید سولفید هیدروژن مورد استفاده قرار می گیرد. سولفات فرو برای مشخص نمودن این محصول نهایی بی‌رنگ به کار برده می شود. بعد از انکوباسیون، تنها کشت ارگانیسم‌هایی که قادر به تولید گاز می باشند در ته لوله رنگ سیاه ایجاد می کنند. به این دلیل که رسوب سولفید فروس غیرمحلول ایجاد می گردد[۲۱].

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۱-۵-۱-۳- آزمایش IMVIC
برای افتراق گروه‌های اصلی خانواده انتروباکتریاسه می توان از خواص بیوشیمیایی و واکنش‌های آنزیمی آنها در حضور سوبسترای خاص استفاده نمود. لذا آزمایش IMVIC که خود شامل آزمایش اندول، متیل رد، وژزپروسکوئر و سیترات می باشد را می توان مورد استفاده قرار داد.
این آزمایش که از تعدادی محیط‌های جامد، نیمه جامد، و مایع تشکیل یافته است. فعل و انفعالات مختلفی را که توسط باکتری‌ها انجام شود، مشخص می‌کند. حروف تشکیل دهنده این آزمایش عبارتند از:
I=Indol V= Voges- proskauer (vp)
M= Methy red C= simmons Citrate
۱-۵-۱-۴- تولید اندول
اندول ماده‌ای حلقوی است که در اثر تجزیه اسید آمینه تریپتوفان حاصل می شود. برای نشان دادن این فعل و انفعال می توان از محیط پپتون واتر و محیط SIM که هر دو حاوی اسید آمینه تریپتوفان هستند، استفاده کرد. باکتری را در محیط‌های فوق کشت داده و پس از ۲۴ تا ۴۸ ساعت برای نشان دادن اندول حاصل از معرف کواکس استفاده می شود. دو تا سه قطره معرف کواکس را به کشت اضافه کرده، چنانچه باکتری آنریم تریپتوفاناز تولید کند رنگ قرمزی تولید می ‌شود. در مورد باکتری‌هایی که قادر به تخمیر نیستند، مانند فلاوباکتریوم و همچنین باکتری‌های بی‌هوازی توصیه می‌شود که از معرف ارلیخ به جای کواکس استفاده شود [۲۲].
۱-۵-۱-۵- متیل رد (MR)
اصول: گلوکز یک منوساکارید ۶ کربنه است که به وسیله همه ارگانیسم‌های روده‌ای برای تولید انرژی اکسیده می گردد. محصول نهایی این فرایند وابستگی زیادی به وجود راه‌های آنزیمی خاصی دارد که در باکتری ها وجود دارد.
در این آزمایش معرف PH (متیل رد) حضور میزان زیادی اسید به عنوان محصول نهایی را مشخص می‌کند. اگرچه همه میکروارگانیسم‌های روده‌ای گلوکز را تخمیر می‌نمایند و اسید آلی تولید می کنند، این آزمایش برای تفکیک دو باکتری اشریشیاکلی و انتروباکتر آئروجنز دارای ارزش زیادی است. هر دو این ارگانیسم‌ها در مدت زمان انکوباسیون اولیه به عنوان محصول نهایی، اسید آلی تولید می نمایند. PH اسیدی پایینی (PH= 4) توسط اشرشیا کلی ایجاد می‌شود پایدارتر بوده و تغییر نمی کند [۱۹].
در طی انکوباسیون طولانی‌تر انتروباکتر آئروجنز اسیدهای تولید شده توسط مکانیسم‌های آنزیمی تغییر یافته و به محصولات غیراسیدی مانند ۲ و ۳ بوتان دیول و استوئین (استیل متیل کربینول) تبدیل می شوند. در نتیجه میزان PH بالا رفته و به حدود ۶ می‌رسد.
معرف متیل رد در PH حدود ۴ به رنگ قرمز تغییر می‌یابد که نشان دهنده مثبت بودن آزمایش است. PH معادل هنوز نشان دهنده وجود اسید می‌باشد. اما چون غلظت یون هیدروژن پایین است لذا رنگ معرف به رنگ زرد تغییر یافته و نشان دهنده منفی بودن آزمایش متیل رد است. برای نشان دادن محصول نهایی غیراسیدی حاصل از تخمیر گلوکز به وسیله انتروباکتر ائروجنز به تفصیل در ادامه شرح داده خواهد شد. انجام آزمایش وژزپروسکوئر شباهت زیادی به آزمایش متیل رد دارد [۲۳].
۱-۵-۱-۶- آزمایش وژزپروسکوئر
اصول: آزمایش وژزپروسکوئر به منظور شناسایی توانایی برخی ارگانیسم‌ها در تولید ترکیبات کمتر اسیدی (استوئین) به عنوان محصول نهایی حاصل از تجزیه گلوکز به کار می رود. طی مسیر گلیکولیز، گلوکز به پیرویک اسید متابولیزه می‌شود. پیروات قادراست به مسیرهای متعددی وارد شده و مواد مختلف و متنوعی ایجاد کند که مسیر تولید ۲ و ۳ بوتان دیول یکی از این مسیرهاست. این نوع تخمیر گلوکز که نشانه اختصاصی انتروباکتر آئروجنز است. معرف مورد استفاده در این آزمایش، معرف باریت می‌باشد که شامل مخلوطی از الفا نفتول الکلی و محلول هیدروکسید پتاسیم ۴۰% است. برای شناسایی استیل متیل کربینول نیاز است که این محصول نهایی به ترکیب دی استیل اکسیده شود این واکنش در حضور آلفانفتول به عنوان کاتالیزور و نیز گروه گوانیدین موجود در پپتون محیط MR-VP صورت می گیرد در نتیجه یک کمپلکس صورتی رنگ ایجاد می گردد که باعث ایجاد رنگ قرمز در محیط می شود. گسترش رنگ قرمز تیره در محیط کشت ۱۵ دقیقه بعد از اضافه کردن معرف باریت به محیط نشان دهنده حضور استیل متیل کربینول و مثبت بودن نتیجه آزمایش است. در صورت عدم ایجاد رنگ قرمز در محیط نتیجه آزمایش منفی است[۲۴].
۱-۵-۱-۷- آزمایش مصرف سیترات
اصول: در غیاب گلوکز قابل تخمیر، یا لاکتوز برخی ارگانیسم‌ها توانایی استفاده از سیترات را به عنوان منبع کربن برای تأمین انرژی دارند. این توانایی وابسته به حضور آنزیمی به نام سیترات پرمئاز است که باعث سهولت انتقال سیترات به درون سلول می‌شود سیترات یک ترکیب حد واسط هم در چرخه کربس است و از ترکیب اسید اگزالواستیک و استیل فعال، ایجاد می‌شود. در اثر تأثیر آنزیم سیتراز، سیترات به اگزالواستیک اسید و اسید استیک تبدیل می شود. این محصولات تحت آنزیم‌ها به پیرویک اسید و دی اکسید کربن تبدیل می شود. در طی این واکنش محیط قلیایی شده، CO2 با یون سدیم و آب ترکیب شده و بی‌کربنات سدیم که یک ماده قلیایی است تولید می شود. در اثر وجود سدیم‌بی‌کربنات معرف بروموتیمول بلو باعث تغییر رنگ محیط می شود و آن را از سبز به آبی تیره تغییر می دهد.
بعد از دوره انکوباسیون کشت‌های سیترات مثبت، با رشد در سطح مورب محیط کشت همراه با ایجاد رنگ آبی شناسایی می شود. کشت‌های سیترات منفی عدم رشد را نشان می دهد و رنگ محیط کشت به همان رنگ سبز باقی می ماند [۲۴].
۱-۵-۱-۸- آزمایش مصرف استات
اصول: برخی از باکتری‌ها قادرند از استات به عنوان تنها منبع کربن استفاده کنند. این صفت در شناسایی باکتری‌های خانواده انتروباکتریاسه اهمیت دارد و در تمایز اشریشیا کلی از گونه شیگلا مفید است . شیگلا نمی تواند از استات استفاده کند، در صورتی که سویه‌های متفاوت اشریشیا کلی قادر به استفاده از این منبع کربن هستند.
محیط کشت مورد استفاده در این آزمایش مشابه محیط سیمون سیترات آگار است که در آن استات جایگزین سیترات شده است. تولید ترکیبات قلیایی با وجود معرف بروموتیمول آبی مشخص می‌شود. تغییر رنگ، تنها زمانی با ارزش است که محیط کشت دارای قند و یا ترکیبات پروتئینی پپتونه نباشد، زیرا در صورت وجود قند در محیط کشت باکتری می تواند اسید تولید کند و در صورت وجود ترکیبات پپتونه قادر است که ترکیبات قلیایی را به وجود آورد، در هر دو حالت در تغییر رنگ معرف اثر می گذارد [۲۵].
باکتری مورد نظر را در محیط غذایی سیمون استات (استات به جای سیترات) کشت داده و در مدت یک تا هفت روز مورد بررسی قرار دهید. چنانچه باکتری قادر به استفاده از استات باشد، تغییر رنگ از سبز به آبی ظاهر شده و نتیجه مثبت است [۲۵].
۱-۵-۱-۹- آزمایش اوره آز
آزمایش اوره آز معمولاً برای شناسایی باکتری‌های جنس پروتئوس مورد استفاده قرار می گیرد، اما برخی از باکتری‌های دیگری که در پزشکی اهمیت دارند نیز اوره آز تولید می کنند. آنزیم اوره آز بر روی اوره موجود در محیط کشت اثر کرده و آن را به آمونیاک، گاز کربنیک و آب تبدیل می‌کند.
آمونیاک حاصل موجب بالا ر فتن PH و در نتیجه قلیایی شدن محیط می‌شود. اگر باکتری را در محیط حاوی اوره کشت دهیم، در صورتی که اوره را تجزیه کند و آمونیاک به وجود آورد، به علت وجود معرف فنل رد در محیط، رنگ ارغوانی ظاهر می‌شود [۲۶].
۱-۶- پروتئوس
سه جنس پروتئوس،مورگانلا، پروویدنسیا درحال حاضرشامل ده گونه است.همه آنها متحرک باسیل­های میله های گرم منفی باتاژه­های پیرامونی می باشند. اکثرا به طورقابل توجهی توانایی اکسیداتیو -Dآمین فنیل آلانین را دارند ودراکثرموارد بجز پروویدنسیا قادر به همولیز اوره می باشند. ویژگی های غیرمعمول شامل توانایی پروتئوس درسوارمینگ می باشد، و ازدیدگاه بالینی بیشتر مورد توجه است و از عوامل بیماریزایی و عفونت انسانی بیشتر در ارتباط با بستری طولانی مدت و در مورد پروتئوس و مورگانلا ناشی از کلونیزاسیون کاتتر بوده وعفونت های دستگاه ادراری است [۲۷] .
۱-۶-۱- طبقه بندی وتکامل نژادی:
پایه و اساس طبقه بندی قبل ازظهورفیلوژنیک براساس مجموعه ای ازتست های بیوشیمیایی شکل گرفت که به سه جنس پروتئوس ،پروویدنسیا و یک جنس جدید مورگانلا تقسیم شدند. مهم­ترین ویژگی های مشترک آنها اکسیداسیون (دآمیناسیون) فنیل آلانین و تریپتوفان می باشد. تمایز بین این سه جنس و دیگر انتروباکتریاسه دراین است که دآمیناسیون تولید نمی کنند.آزمایش برای تولید دآمیناسیون در۱۹۵۰ انجام شده که هنوز هم در حال توسعه می­باشد [۲۸] .تنها تست تمایز مورگانلا از پروتئوس و پروویدانسیا تست لیزین آیرون آگار است. پروویدانسیا هم بدلیل تولید اسید از انواع قندها قابل تشخیص می باشد، در حالیکه پروتئوس توسط هیدرولیز ژلاتین و تولید لیپاز و هیدروژن سولفید تشخیص داده می­ شود. روش­های فیلوژنتیک مولکولی و
طبقه بندی براساس ارتباطی که در سطح DNA دارند منجرشده که به چندین جنس و گونه تقسیم می­شوند که می­توان به تغییر پروتئوس مورگانی به مورگانلا اشاره کرد [۲۹].
جنس پروتئوس اخیرا شامل ۴گونه است.
پروتئوس میرابیلیس ، ولگاریس ، پنری ، میکسوفیشن[۳۰].

1. 1. mirabilis swarmer cell P. vulgaris;

تصویر۱-۱-شکل باکتری پروتئوس
۱-۶-۲- جایگاه:
پروتئوس میرابیلیس گونه ای ازجنس پروتئوس است که مطالعات گسترده درمورد آن انجام شده است،و اولین بارتوسط Hauser درسال ۱۸۸۵ توصیف ونامگذاری شد. دارای توانایی تغییرشکل مختلف به منظورفرار است[۳۱]. هردونوع پروتئوس میرابیلیس و ولگاریس به طورطبیعی درمحیط وجود دارند.ازروده پستانداران، پرندگان وخزندگان جدا شده است.
پروتئوس میرابیلیس وبه میزان کمتر ولگاریس عموما ازساکنان دستگاه گوارش انسان هستند. پروتئوس میرابیلیس همچنین به طورویژه تحت شرایط خاصی دردستگاه ادراری یافت می شود و یک پاتوژن فرصت طلب و یکی از علل اصلی عفونت ادراری در بیماران بستری در بیمارستان به دلیل استفاده ازکاتتر می باشد. پروتئوس ولگاریس همچنین ازپاتوژن های دستگاه ادراری است اگرچه این ارتباط کمتری با عفونت ادراری دارد[۳۲].
۱-۶-۳- جداسازی وشناسایی:
شرایط رشدبهینه برای گونه های این باکتری C° ۳۷ است و باکتری به شکل میله های کوتاه با شش تا ده فلاژله وپری تریش می باشد.رفتارسوارمینگ باعث شده جداسازی کلنی تک برای مطالعه بیشترسخت باشد.اگرچه جداسازی کلنی روی آگار می تواند از افزایش غلظت آگار g/l 20 و اضافه کردن ml 5 گلیسرول به ازای هرلیترتا حدودی سرعت حرکت کم وازشروع سوارمینگ جلوگیری می کند ومنجربه تشکیل کلنی مجزا می شود [۳۳].
تست اندول توسط بیل وهمکاران (۱۹۸۵) موردبررسی قرار گرفت وروش سریع برای تشخیص پروتئوس میرابیلیس از ولگاریس است. دراین ارزیابی اکثریت ۷/۹۵ درصد ازپروتئوس میرابیلیس اندول منفی و۹/۸۸ ازپروتئوس ولگاریس ها اندول مثبت بوده است [۳۴].
۱-۶-۴- فیزیولوژی:
تمایزسلولی وسوارمینگ یکی از ویژگی های فنوتیپی مشترک در اعضای جنس پروتئوس است که توانایی سوارمینگ در زمانی که روی یک محیط کشت نیمه جامد کشت شود به خوبی دیده می شود. این مشخصه مرحله سوارمینگ پروتئوس به طورگسترده مطالعه شده است [۳۵] وزمانیکه درمحیط مایع رشد داده می شود. باکتری به شکل میله ای با اندازه ۲-۵/۱ میکرون و با تاژه پیرامونی ۶ تا ۱۰ عدد دیده می شود، که سلول شناگر نامیده می شود.سلول های شناگر با مشخصه ی شنا_­ور،رفتارکموتاکسیک، حرکت، جذب و دفع مواد زائد نقش دارند [۳۶]. انتقال سلول شناگربرروی محیط کشت جامد، مانند آگار نتایج چشمگیری درانتقالات فیزیولوژیکی ومورفولوژیکی باکتری دارد.مدت کوتاهی بعد از تماس با سطح، سلول شناگر شروع به تمایز منحصر به فرد به لحاظ مورفولوژیک و بیوشیمیایی می کند. اولین گام درمورفولوژیک سلول شناگر افزایش طول سلولی است. درنتیجه ممانعت ازمکانیسم جهش و تقسیم می کند [۳۷]. دراین شرایط در نتیجه مهار چرخشی تاژه پیرامونی، به این نتیجه رسیدند که عمل تاژک بعنوان سنسورهای محیطی ازمحیط خارجی است. درعوض حرکت سوارمینگ تماس سلول به سلول هست که به تماس وتعامل بین گروه ها وهماهنگی بین حرکات آنها نیازدارد [۳۸] .

تصویر۱-۲- چگونگی حرکت سوارمینگ پروتئوس
۱-۶-۵- اکولوژی:
هردونوع پروتئوس میرابیلیس و ولگاریس اعضای فلور طبیعی روده پستانداران هستند. و از روده پستانداران، انسان، سگ، خوک، گوسفند، گاو، گربه و موش و……جدا شده است.