ژل آگارز

این ژل معمولاً به میزان ۱% تا ۳% در بافر­های مختلفی مانند TAE، TBE تهیه می­ شود. برای تهیه ژل آگارز ۱% ۲ g از آگارز با۱۰ میلی­لیتر بافر x) 10TBE ( مخلوط شد و بعد حجم آن با آب مقطر به ۲۰۰ میلی­لیتر رسانده شد. به مدت ۵ دقیقه در داخل مایکروویو حرارت داده شد تا بجوش آید و آگارز حل شود. مدتی پس از سرد شدن lμ ۸ اتیدیوم بروماید به آن اضافه گردید(۴۰) .

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۲-۳-۲-۲ روش کار

۱- ۲/۰گرم از بافت برگی پودر شده در میکروتیوب ریخته شد.
۲- مقدار ۷۰۰ میکرولیتر از بافر CTAB به پودر برگ اضافه شد سپس به کمک ورتکس یا تکان دادن بهم زده شد و حدوداً تا۲ ساعت داخل بن­ماری ۶۰ درجه قرار داده شد و هر ۵ دقیقه یک بار تکان داده شد.
۳- مقدار ۷۰۰ میکرولیتر از محلول کلروفرم-ایزوآمیل الکل ۲۴:۱ به آن اضافه کرده و خوب محلول را تکان داده تا به رنگ شیری درآید.
۴- سپس آنرا در rpm ۱۳۰۰۰ به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ کرده و این مرحله بسته به شفافیت محلول رویی ۲ تا ۳ بار تکرار ­شد.
۵– مایع زلال بالایی با بهره گرفتن از میکروپیپت بر­داشته شده و به تیوب میکروفوژ ml5/1 استریل منتقل گردید و به ۳/۲ حجم نمونه داخل تیوب محلول ایزوپروپانول سرد (نگهداری شده در ۲۰- درجه سانتیگراد) اضافه شد و۵ دقیقه خوب تکان داده شد.
۶- محلول داخل تیوب­ها به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ (۴ درجه سانتیگرادrpm ۱۳۰۰۰) شد تا DNA در کف آن رسوب نماید.
۷- سپس مایع رویی را دور ریخته و رسوب DNA را با بافر شستشو (lμ ۱۰۰ اتانول ۷۰% و lμ ۱۰۰ استات آمونیوم) ۲ بار شستشو داده وگذاشته رسوب DNA خشک شود (اتانول به طور کامل تبخیر شود).
۸- در این مرحله، lμ۱۰۰ RNasae رقیق شده به رسوب DNA اضافه کرده و به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه در ترمو­میکسر قرارگرفت.
۹- به نمونه­ها lμ۲۰۰، NaCl 5 مولار اضافه شد.
۱۰- دو برابر حجم موجود در تیوب اتانول ۱۰۰% اضافه شد (lμ۱۰۰ RNasae +lμ۲۰۰ Nacl).
۱۱-نمونه­ها به مدت ۲۰ دقیقه در فریزر ۲۰- قرار داده شد.
۱۲- نمونه­ها به مدت ۵ دقیقه در دستگاه سانتریفوژ با دور rpm 13000 قرار گرفت.
۱۳- مایع روئی بیرون ریخته شد و بعد رسوب DNA با lμ۱۰۰ اتانول ۷۰% شستشو داده شد.
۱۴- درانتها، به رسوب DNA، lμ۵۰ آب دیونیزه اضافه شد.
۱۵- نمونه­ها به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۲۰- درجه نگهداری شدند تا DNA به خوبی حل شود(۴۰).

۲-۴ تعیین کیفیت وکمیت DNA:

۲-۴-۱ استفاده از ژل آگـارز:
در این روش وضعـیتDNA از لـحاظ سالم بودن و نداشتن شکـستگی مـورد بررسی قرار گـرفت. در این روش ۵ میکـرولیتر DNA پایه از نمونه استخراجی با ۵ میکـرولیتر آب مقـطر مخلوط و به آن ۳ میکـرولیتر لـودینگ بافـر اضافه و در ژل آگارز ۱% به مدت ۶۰ دقیقه با ولـتاژ ثابت ۸۰ ولت الکـتروفورز گـردید. در نهایتDNA­هایی انتخاب شدند که بر روی ژل آگارز تشکیل یک باند پر رنگ در بالای ژل دادند در صورتی که نمونه DNA دارای شکستگی باشد، بر روی ژل حالت اسمیر مشاهده می­ شود(۴۰).
۲-۴-۲ روش اسپکتروفتـومتری:
این روش بر مبنای اندازه­گـیری طیف جذبی DNA توسط دستگاه اسپکـتروفتومتری می­باشد(شکل ۲-۳). میزان جذب نور توسط اسیدهای نوکلیئک، پروتیئن­ها و ترکیبات فنلی به ترتیب در طول موج­های ۲۶۰ ،۲۸۰و ۲۳۰ نانومتر صورت می­گیرد و طول موج ۳۲۰ نانومتر معرف میزان آلودگی­ها در نمونه­های استخراج شده است. خلوص کیفیت DNA بر اساس نسبت طول­موج­های ۲۸۰/۲۶۰ و ۲۳۰/۲۶۰ تعیین گردید چنانچه نسبت ۲۸۰/۲۶۰ در محدوده ۲-۷/۱باشد، DNA از کـیفیت قـابل قبولی برخوردار خواهد بود، همچنین این دستگاه غلظت DNA (کمیت) را نیز نشان می­دهـد.
غلظت DNA بر حسب نانو­گرم در میکرولیتر از طریق فرمول زیر محاسبه شد:
۵۰ ضریب رقتA260 =غلظت DNA (نانو گرم در لیتر)
برای کالیبره نمودن دستگاه ابتدا درون کوئت ، ۲۰۰ میکرولیتر آب دیونیزه ریخته و در دستگاه قرار داده شد پس از زدن کـلید
Blank زمانی که دستگاه عدد صفر را نشان داد کالیبره شده است. پس از کالیبره شدن، داخل کوئت، ۱۹۸ میکرولیتر آب دیونیزه به همراه ۲ میکرولیتر DNA استخراج شده ریخته و مقادیرA260 ، A280، A230 و غلظت بر حسب نانوگرم یـادداشت شد.در این پـروسه چون ۲ میکـرولیتر از محلول پایهDNA در ۱۹۸ میکرولـیتر آب دیـونیزه ریخته شد، پس محلول پایه ۱۰۰ برابر رقیق شده است:
۱۰۰ = ۲/۲۰۰ = ظریب رقت
در طول موج ۲۶۰ نانومتر، OD مساوی یک برابر با ۳۰ نانوگرم در میکرولیتر ds DNA Strand) (double است. جهت یکسان نمودن غلظت کلیه DNA پایه در واکنش PCR (30 نانو گرم در میکرولیتر)، DNA با نسبت معینی از آب دیونیزه که از فرمول زیر بدست می آید رقیق شد:
C1V1=C2V2
C1= غلظت DNA در محلول پایه. V1 =حجم محلول پایه که باید برداشته شود. C2 =غلظت DNA در محلول مصرفی. V2 =حجم کل محلول که بایستی تهیه شود
نمونه های DNA‌ اصلی به دمای ۲۰- درجه منتقل شدند.
شکل ۲-۳ دستگاه اسپکتروفتومتر برای تعیین کمیت DNA

۲-۵ واکنش زنجیره ای پلیمراز) (PCR :

واکنش PCR به کمک دستگاه ترموسایکلر انجام شد. حجم نهایی واکنش۲۵ میکرولیتر بود. ترکیب مواد استفاده­شده در PCR به شرح جدول (۲-۲) می­باشد.
محلول پایه واکنش PCR، شامل همه مواد مورد­نیاز برای واکنش به جز نمونه DNA بود. ابتدا براساس تعداد نمونه DNAمورد­استفاده در هر بار واکنش PCR، نسبت­های مشخصی از هر یک از اجزای واکنش برداشته شده و در یک تیوپ به خوبی با هم مخلوط گردید، سپس به مقدار ۲۲ میکرولیتر از محلول پایه به هر یک از تیوپ­هایPCR که از قبل۳ میکرولیتر از DNAمورد­نظر در آنها قرار داده شده است، اضافه گردید. تمامی مراحل آماده ­سازی واکنش PCR برروی یخ صورت گرفت. تیوپ­های PCR سپس در دستگاه ترموسایکلر(شکل۲-۴) قرار داده شدند و مطابق چرخه زمانی داده­ شده به دستگاه ، واکنش PCR انجام شد. برنامه چرخه­های دمایی واکنش زنجیره پلی­مراز در جدول (۲-۳) آمده است. برنامه PCR بصورت time releaseانجام شد.
پس از اتمام PCR نمونه ها از دستگاه خارج و تا انجام الکتروفورز در یخچال نگهداری شدند(۴۰) .
جدول ۲-۲ ترکیب مواد استفاده شده در PCR :

اجزاء واکنش

برای یک نمونه

بافرX 10

lµ ۵/۲

Forward primer