D12S1297

۵۲

۲۳۶

tetra

D12S64

TOUCH DOWN
۷۰-۶۰

۱۰۷

di

D12S824

۵۸٫۸

۲۴۵

tetra

شکل ۳-۷ موقعیت مارکرهای ژن OTOGL
۳-۷-۳-۲ تعیین هتروزیگوسیتی مارکرهای STR در جمعیت ایران
فرکانس آللی مارکرهای ژنتیکی در هر جمعیت با جمعیت دیگر متفاوت است. از آن جایی که تنوع آللی این مارکرها در جمعیت ایران بررسی نشده است، در ابتدا می بایست این تنوع به طور تقریبی در ایران مشخص شود. برای رسیدن به این هدف ۱۰ فرد نرمال انتخاب شد. سپس هر کدام از این مارکرهای STR انتخاب شده، به کمک روشPoly Acryl amide Gel Electrophoresis مورد بررسی قرار گرفتند و مارکرهایی انتخاب شدند که دارای هتروزیگوسیتی بالاتری در جمعیت ایران بودند..

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

هر چه هتروزیگوسیتی مارکر انتخاب شده بیشتر باشد، نشان دهنده informative بودن آن مارکر در جمعیت مورد بررسی است.
۳-۷-۴ واکنش زنجیره ای پلیمراز^[۵۶]
مهمترین و بهترین تکنیک که در آن مولکول DNA به آسانی تکثیر می یابد روش PCR است. تکثیر DNA در این روش فوق العاده سریع و به طور متوسط طی ۳-۲ ساعت انجام می شود.
ابتدا به وسیله حرارت (۱۰۰-۹۲ درجه سانتی گراد) دو رشته DNA از هم باز شده و به صورت تک رشته در می آیند. به طور تقریبی برای شکستن هر پیوندAT دو درجه سانتی گراد و برای شکستن هر باند CG چهار درجه سانتی گراد حرارت لازم است که به آن دمای ذوب^[۵۷] می گویند. سپس با پایین آمدن دما اجازه اتصال آغازگرها^[۵۸] (Forward + Reverse) به محل های مکمل خود در DNA هدف فراهم می شود. پس از آن با فراهم نمودن دمای مناسب (۷۲ درجه سانتی گراد) برای فعالیت آنزیم DNA Taq Polymerase ساخت رشته های مکمل در DNA، در امتداد ۵^‘ به ۳^‘ پرایمرها آغاز می شود.
سه مرحله فوق به طور اتوماتیک در دستگاه ترموسایکلر قابل برنامه ریزی خواهند بود.یک پروتکل PCR معمولا شامل ۴۰-۲۵ سیکل می باشد. از نظر تئوری قطعه هدف در هر سیکل دو برابر شده و بنابراین محصول ساخته شده به شکل تصاعدی افزایش می یابد.
روش PCR یک روش نسبتاً ساده و سریع جهت تعیین جهش های نقطه ای، حذف و اضافه شدن چند نوکلئوتیدی و چند شکلی ها^[۵۹] است. در این روش از آن جایی که هر فرد در هر جایگاه ژنی دارای دو آلل می باشد بنابراین در صورتی که جهش در ژن موجود در جایگاه ژنی مورد بررسی عامل بیماری باشد در صورت توارث اتوزومی مغلوب بیماری، انتظار می‌رودکه فرد مبتلا برای جهش مورد نظر هموزیگوت باشد، که به دلیل دریافت آن جهش از یک جد مشترک است. بنابراین در بررسی مارکرها فقط یک باند قابل رویت است و در غیر این صورت دو باند (برای افراد هتروزیگوت نرمال) و یا یک باند (برای افراد هموزیگوت نرمال) می توان مشاهده کرد.
در صورت توارث اتوزومی غالب بیماری، انتظار می رود که دو باند (باند نرمال و باند جهش یافته) برای افراد مبتلا مشاهده شود و افراد نرمال، باند جهش یافته را به ارث نبرده باشند.
چون STR ها معمولاً ۵۰ جفت باز طول دارند، می توان از PCR برای تکثیر قطعات DNA که شامل مناطق کامل تکرار هستند و از ژل الکتروفورز برای مشخص کردن تفاوت ها در محصول تکثیر شده از منابع مختلف DNA ژنومی استفاده کرد. به کمک یک جفت پرایمر در طرفین هر یک از مارکرهای STR انتخاب شده می توان ناحیه ژنومی مورد نظر را تکثیر کرد. جهت تکثیر این مارکرها به دلیل اینکه اکثراً نوکلئوتیدهایی مثلCA یا TG پشت سر هم تکرار می شوند به سادگی و براساس پروتکل های روتین PCR می توان این مارکرها را تکثیر کرد.

مواد لازم برای واکنش PCR
آنزیم polymerase Taq DNA
منشاء آنزیم DNA پلیمرازی که در PCR استفاده می شود از باکتری Thermus aquaticus است. این آنزیم مقاوم به حرارت بوده واز عوامل بسیار مهم گسترش تکنیک PCR در آزمایشگاه های تحقیقاتی و کلینیکی است. در واکنش های PCR معمولی، آنزیم Taq DNA polymerase، آنزیم انتخابی می باشد. غلظت زیاد آنزیم گاهی منجر به کاهش اختصاصی بودن واکنش می شود که گاهی به صورت اسمیر^[۶۰] مشاهده می شود و چنانچه مقدار آنزیم کمتر از حد مورد نیاز واکنش باشد محصول مورد نظر به اندازه کافی تولید نمی شود.
آنزیم Taq پلیمراز به صورت یک زنجیره پلی پپتیدی واحد با وزن مولکولی ۹۵ کیلودالتون است که واجد فعالیت پلیمرازی ´۵´۳ و فاقد فعالیت اگزونوکلئازی´۳´۵ می باشد. این آنزیم حداکثر فعالیت خود را در ۹pH و دمای ۷۵ درجه سانتی گراد داراست. آنزیم Taqپلیمراز قادر است در هرثانیه ۶۰ باز را به رشته DNA اضافه کند و فاقد خاصیت proof reading است. نیمه عمر این آنزیم در ۹۵ درجه سانتی گراد حدود ۴۰ دقیقه است.
پرایمر
درواکنش PCR پرایمرها به دو طرف توالی هدف اتصال می یابند و امکان شروع فعالیت پلیمرازی آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می آورند.
طول پرایمرها باید در حدود bp 30-20 باشد.
توزیع یکنواختی از توالی های غنی از A/T وC/T می بایست وجود داشته باشد.
انتهای ۳^‘ پرایمرها نباید مکمل هم باشند تا دایمرهای پرایمری تشکیل نشود.
داکسی نوکلئوتید تری فسفات^[۶۱]
آنزیمهای پلیمراز سنتز زنجیره پلی نوکلئوتیدی را از مونومرها کاتالیز می کنند. همان طور که در سنتز طبیعی DNA از چهار نوع نوکلئوتید استفاده می شود، در واکنش PCR نیز چهار نوع نوکلئوتید dCTP،dGTP، dTTP و dATP مورد نیاز است. از هر کدام از این نوکلئوتیدها درحدود ۲/۰ mM نیاز است. نکته ای که در اینجا اهمیت دارد این است که باید از غلظت برابری از هر نوع نوکلئوتید استفاده شود، زیرا عدم تعادل در غلظت این نوکلئوتیدها منجر به کاهش دقت آنزیم پلیمراز می شود.