۳-۳-۲: مواد استفاده شده جهت انجام PCR
بافر ۱۰X (10X Buffer)
MgCl₂
پرایمر­های رفت و برگشت برای ژن­های GPX1 و SOD1

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

dNTP
Taq Polymerase
همگی ساخت سینا ژن
۳-۳-۳: مواد استفاده شده جهت انجام الکتروفورز
بافر TBE (X 5/0)
Agarose (ساخت Invitrogen)
۶X Loading Buffer (سینا ژن)
محلول اتیدیم برماید (X 1000)
DNA Ladder 100bp (Vivantis)
Boric acid (Merck)
Tris base (Merck)
EDTA (Merck)
۳-۳-۴: مواد استفاده شده جهت اثر دادن آنزیم محدود کننده
آنزیم­ های محدود کننده ApaI و MspI (ساخت Fermantas )
B Buffer برای آنزیم ApaI
Tango Buffer برای آنزیم MspI
استخراج DNA به روش جوشاندن (Boiling)
۳-۴-۱: ساخت محلول­های مورد نیاز جهت استخراج
برای ساخت محلول NH₄Cl(170 میلی­مولار) ۱/۰گرم NH₄Cl را در ۱۰ سی­سی آب استریل حل شده و بلافاصله استفاده مورد استفاده قرار می­گیرد.
در تهیه محلول NaCl-EDTA (10 میلی­مولار) ۹/۰ گرم EDTA و ۱۴۶/۰ گرم NaCl مورد نیاز هستند که در ۲۵۰ میلی­لیتر آب مقطر حل شده و pH آن به ۵/۷ رسانده می­ شود. این محلول پیش از استفاده باید اتوکلاو گردد.
محلول NaOH (50 میلی­مولار) از ۵/۰ گرم NaOH در ۲۵۰ میلی­لیتر آب مقطر تهیه شده و پیش از استفاده اتوکلاو شد.
برای ساخت محلول Tris-HCl (یک مولار) ۹۴/۳ گرم Tris-HCl در ۲۵ میلی­لیتر آب مقطر حل شده و pH آن به ۵/۷ رسانده شد. این محلول نیز پیش از استفاده اتوکلاو گردید.
۳-۴-۲: فرایند استخراج به روش جوشاندن
فرایند استخراج توسط محلول­های تهیه شده و با بهره گرفتن از ۲۰۰ میکرولیتر خون براساس روش ارائه شده در منبع انجام شد (Newton, 1995 ).

تعیین ژنوتیپ با روش PCR-RFLP^[25]
۳-۵-۱: PCR
از واکنش زنجیره­ای پلیمراز یا PCR جهت تعیین ژنوتیپ­ چند­شکلی­های­ ژنتیکی ژن­های GPX1pro198leu و SOD1A251G استفاده شد. در جدول ۱ شرح مواد مورد نیاز برای انجام یک واکنش PCR آمده است. به منظور انجام PCR ابتدا تمامی اجزا گفته شده در جدول به جز Taq polymerase از فریزر ۲۰- درجه سانتی گراد خارج و در دمای اتاق قرار داده می­شوند..
پس از ذوب شدن، تمامی اجزاء ورتکس شده و به یخ چهار درجه سانتی ­گراد برای انجام سایر مراحل انتقال داده می­شوند. پس از اضافه شدن DNA الگو تیوب­ها توسط دستگاه، spin down شده و در دستگاه PCR قرار داده می­شوند.
جدول ۳-۲: مواد مورد نیاز برای انجام PCR

اجزاء واکنش
میزان مورد نیاز برای هر واکنش (میکرولیتر)

۱۰x buffer

۵/۲

MgCl₂ (۵۰ mM)

۷۵/۰

Forward primer (10 μM)

۱