۴۰۳/۰

۶/۹۱

۵/۲

دیالیز

۳۱/۱۲

۶۰۸/۴

۳۷۴/۰

۷/۸۱

۰/۳

ستون Q-سفاروز

۲۷۷/۰

۹۳۲/۰

۳۶۵/۳

۵/۱۶

۹/۲۶

شکل ۴-۴- تصویر SDS-PAGE 5/12 % از مراحل تخلیص آنزیم TTL؛
۱) عصاره سلول قبل از القا، ۲) عصاره سلول ۶ ساعت بعد از القا، ۳) عصاره سلول ( پس از سونیکیت)،
۴) محتوای پروتئینی پس از رسوب دهی دمایی، ۵) آنزیم خالص پس از ستون Q- سفاروز، ۶) مارکر وزن ملکولی پروتئین
۴-۳- سنتز مایعات یونی
مایعات یونی [C₂MIM][Br]، [C₄MIM][Br]، [C₆MIM][Br]، [C₁₂MIM][Br]، [C₄MIM][PF₆]، [C₆MIM][PF₆] بر اساس روش گفته شده در بخش ۳-۳-۱، سنتز شدند. گرانروی این مایعات یونی با افزایش طول زنجیره افزایش می­یابد و مایع یونی [C₁₂MIM][Br] در دمای اتاق به صورت جامد است. مایعات یونی دارای آنیون PF₆^– به طور کلی گرانروی بیشتری نسبت به مایع یونی دارای آنیون Br^– دارند.
۴-۴- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL
در این بخش با افزودن مایع یونی با غلظت­های نهایی مشخص در مخلوط واکنش اثر طول زنجیره آلکیلی کاتیون ([C_nMIM] n=2,4,6,12) و غلظت­های مایع یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم لیپاز TTL مورد بررسی قرار گرفت. تمامی آزمایشات دو بار تکرار شدند و به دلیل نزدیک بودن نتایج به هم، از اعداد به دست آمده از دو تکرار میانگین گرفته شد. در مایعات یونی مورد بررسی، مایعات یونی با زنجیره­های کوتاه آلکیلی اثر مطلوب بیشتری بر فعالیت آنزیمی داشته اند و در زنجیره­های بلند کربنی کاهش فعالیت را می­توان دید.
همان­طور که در نمودار نشان داده شده است(شکل ۴-۵)، با افزایش غلظت مایعات یونی در ابتدا افزایش فعالیت هیدرولازی TTL تا رسیدن به یک غلظت بهینه را می­توان دید و غلظت­های بالاتر از آن سبب کاهش فعالیت آنزیمی شده ­اند. هرچند در رابطه با مایع یونی [C₁₂MIM][Br] تنها اثر کاهشی بر فعالیت آنزیم دیده شد. بیشترین اثر افزایشی در فعالیت هیدرولازی TTL را می­توان به ترتیب در رابطه با مایعات یونی [C₄MIM][Br]، [C₂MIM][Br]، [C₆MIM][Br] دید. بیشترین فعالیت نسبی آن­ها به ترتیب ۲۵۴%، ۱۷۷% و ۱۳۵% بود که به ترتیب در غلظت­های ۱۰۰۰، ۳۰۰ و ۳۰۰ میلی مولار از مایع یونی به دست آمدند.
شکل ۴-۵- اثر غلظت­های مختلف مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی
۴-۵- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL
۴-۵-۱- پایداری دمایی TTL در عدم حضور مایعات یونی
با توجه به نمودار پایداری دمایی (شکل ۴-۶) آنزیم TTL در محیط بافری در دمای ۷۵ درجه سانتیگراد پس از گذشت یک ساعت همچنان ۹۰ درصد از فعالیت خود را حفظ می­ کند. اما در دمای ۸۰ درجه سانتیگراد آنزیم با گذشت زمان به مرور پایداری خود را از دست می­دهد. پس از گذشت یک ساعت حرارت­دهی در دمای ۸۰ درجه سانتیگراد ۳۹ درصد از فعالیت باقی خواهد ماند. در دماهای بالاتر از ۸۰، دمای ۸۲ و °C 85، آنزیم کاملا ناپایدار بوده و پس از گذشت ۱۵ دقیقه از حرارت­دهی هیچ فعالیتی مشاهده نشد.
شکل ۴-۶- نمودار پایداری آنزیم TTL در دماهای بالا در بافر تریس mM 50 ، ۸≈pH.
۴-۵-۲- پایداری دمایی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی
۴-۵-۲-۱- بررسی پایداری TTL در [C₄MIM][Br] و ] [C₄MIM][PF₆ در دماهای مختلف
بررسی پایداری دمایی در مخلوط آبی [C₄MIM][Br] با غلظت ۱ مولار، در دمای °C 90 افت شدیدتری در پایداری آنزیم نسبت به دمای °C 85 را نشان می­دهد. همان­طور که در نمودار پایداری دمایی (شکل ۴-۷) می­توان دید، در دمای °C 85، در محیط [C₄MIM][Br]، بیش از ۹۰ درصد از فعالیت آنزیمی تا ۳۰ دقیقه حفظ شده است و بعد از گذشت یک ساعت از حرارت­دهی همچنان بیش از ۶۰ درصد از فعالیت آنزیمی باقی می­ماند. آنزیم TTL در محیط [C₄MIM][Br] در دمای °C 90، پس از گذشت ۱ ساعت، ۴۵ درصد از فعالیت خود را حفظ می­ کند. نتایج نشان می­دهد که پایداری دمایی آنزیم در محیط [C₄MIM][PF₆] به شدت افزایش یافته است. آنزیم TTL در محیط [C₄MIM][PF₆] پس از ۴۵ دقیقه حرارت­دهی در دمای °C 85، همچنان ۹۶ درصد از پایداری خود را حفظ کرده است. با افزایش دما به °C 90 توانایی مایع یونی [C₄MIM][PF₆] در حفظ پایداری آنزیم به همان شدت قبل است. همان­طور که در نمودار B از شکل ۴-۷ مشاهده می­ شود، آنزیم TTL در مایع یونی [C₄MIM][PF₆] پس از گذشت ۹۰ دقیقه حرارت­دهی در °C 90 و °C 85، هم­چنان ۷۲ درصد از فعالیت اولیه خود را حفظ می­ کند.
شکل۴-۷- نمودار پایداری TTL در [C₄MIM][Br] و [C₄MIM][PF₆] در دماهای °C 85 و °C 90.
الف) محیط [C₄MIM][Br] ب) محیط [C₄MIM][PF₆].
۴-۵-۲-۲- مقایسه اثر نوع آنیون مایعات یونی بر پایداری دمایی
مایعات یونی ایمیدازولیومی بسته به نوع آنیونی که در ساختار خود دارند، شدت اثر پایدارکنندگی متفاوتی را از خود نشان می­ دهند. برای مثال در مقایسه­ ای بین مایعات یونی [C₄MIM][PF₆] و [C₄MIM][Br] در دماهای بالا (°C85 و °C90) اثر پایدارکننده بیشتری در مورد مایع یونی دارای آنیون ^–PF₆ می­توان دید (شکل۴-۸).در دمای °C85 ، ۹۶ درصد از آنزیم­ها در محیط [C₄MIM][PF₆] پس از ۴۵ دقیقه حرارت دهی پایدار مانده­اند و پس از آن شیب ملایمی از کاهش پایداری TTL مشاهده می­ شود و پس از ۹۰ دقیقه همچنان ۷۰ درصد از آنزیم­ها پایداری خود را حفظ کرده ­اند. در حالی­که پایداری آنزیم در محیط [C₄MIM][Br] طی حرارت­دهی در °C85، با سرعت بیشتری کاهش یافت و در پایان ۹۰ دقیقه حرارت­دهی، ۴۱ درصد از فعالیت اولیه آنزیمی مشاهده شد. با افزایش دما به °C 90 حفظ پایداری آنزیم در محیط [C₄MIM][PF₆] با همان روند قبل دیده می­ شود، در حالی­که در محیط [C₄MIM][Br] روند کاهشی شدیدتری در پایداری آنزیم مشاهده می­ شود. پس از ۶۰ دقیقه حرارت­دهی در °C 90 پایداری به ۴۵ درصد میزان اولیه رسیده است و پس از ۹۰ دقیقه تنها ۳۲ درصد از آنزیم­ها پایدار مانده­اند.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۴-۵-۲-۳- مقایسه اثر نوع کاتیون و طول­های مختلف زنجیره کربنی مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم
پایداری دمایی آنزیم TTL در مایعات یونی ایمیدازولیومی با طول­های مختلف زنجیره کربنی مورد بررسی قرار گرفت. همان­طور که در شکل۴-۹ مشاهده می­ شود مایعات یونی با زنجیره­های ۲، ۴ و ۶ کربنه عملکرد نسبتا مشابهی را در حفظ پایداری آنزیم از خود نشان می­ دهند. در این میان [C₆MIM][Br] با اختلاف کمی نسبت به [C₂MIM][Br] و [C₄MIM][Br]، محیط مناسب­تری را برای حفظ پایداری آنزیم فراهم می­ کند. در مورد این ۳ مایع یونی پس از گذشت ۱ ساعت دمادهی در °C85 بیش از ۵۰ درصد از فعالیت آنزیم همچنان باقی مانده است. همچنین مایعات یونی با زنجیره ۱۲ کربنه هیچ گونه اثر مطلوبی بر پایداری آنزیم نشان نداده است.
همان­طور که در شکل ۴-۱۰ نشان داده شده است، دو نوع مختلف کاتیون از پایه ایمیدازولیوم و پایه پیریدینیوم تفاوت چندانی در میزان پایداری آنزیم ایجاد نمی­کنند. اثر پایدارکننده مشابهی در مورد مایع یونی [C₅Py][Br] و مایعات یونی [C₄MIM][Br] و [C₆MIM][Br] دیده شد. در رابظه با مایع یونی [C₁₂Py][Br] نیز مانند [C₁₂MIM][Br] هیچ اثر مطلوبی بر پایداری دمایی آنزیم مشاهده نشد.
شکل۴-۸- نمودار پایداری دمایی TTL در مایعات یونی؛ مقایسه اثر نوع آنیون.

• A) دمای °C85 B) دمای °C90

شکل ۴-۹- نمودار مقایسه اثر مایعات یونی با طول­های مختلف زنجیره کربنی کاتیون ایمیدازولیوم
بر پایداری دمایی آنزیم
شکل ۴-۱۰- نمودار بررسی اثر نوع کاتیون بر پایداری دمایی آنزیم TTL.
۴-۶- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور و عدم حضور مایعات یونی
در این بخش از پژوهش ابتدا پایداری ساختاری آنزیم در بافر تریس در دمای °C 85 مورد بررسی قرار گرفت. شکل ۴-۱۱ طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 (pH = 8) را در زمان­های مختلف حرارت­دهی در °C 85 (0، ۳۰ و ۶۰ دقیقه) نشان می­دهد. بیشینه نشر فلورسانس در مورد آنزیم TTL قبل از حرارت­دهی ۵۷۰ و در λ_Max ۳۳۳ نانومتر است. پس از حرارت­دهی شدت نشر فلورسانس به شدت کاهش یافته، به طوری که در زمان ۳۰ دقیقه بیشینه نشر به ۳۸۵ ودر زمان ۶۰ دقیقه به ۳۶۸ کاهش یافته است.

شکل ۴-۱۱- طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 پس از حرارت­دهی در °C 85
به منظور بررسی پایداری دمایی ساختار آنزیم درمحیط مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون ^–PF₆ در غلظت ۱۰۰ % ، در دمای °C 85، به مدت ۱ ساعت انکوبه گردید. در مقایسه بین دو طول مختلف زنجیره آلکیلی کاتیون، مایع یونی [C₄MIM][PF₆] با شدت نشر فلورسانس بیش­تر نسبت به [C₆MIM][PF₆]، اثر پایدارکنندگی بیش­تری را از خود نشان داد. در شکل ۴- ۱۲ مشاهده می­ شود که شدت نشر فلورسانس پس از ۱ ساعت حرارت­دهی به آنزیم در دمای °C 85، در محیط [C₄MIM][PF₆] در سطح ۶۱۶ و در مورد [C₆MIM][PF₆] در سطح ۳۳۲ قرار گرفته است. همچنین کاهش λ_Max در محیط [C₆MIM][PF₆] به میزان nm 5 دیده شد.
با بررسی طیف فلورسانس مربوط به TTL تیمار شده در مایع یونی [C₄MIM][PF₆] مقداری کاهش شدت نشر پس از ۳۰ و ۶۰ دقیقه دمادهی در °C85 می­توان دید (شکل ۴-۱۳). با این وجود تفاوت زیادی در نشر فلورسانس بین نمونه­های حرارت دیده در مایع یونی و نمونه آنزیم غیرفعال وجود دارد که این امر گویای حفظ درصد بالایی از ساختار آنزیم در محیط [C₄MIM][PF₆] است.