سرنگ
پارافیلم، پنبه، پنس استریل،برچسب، ماژیک، قیچی و خط کش
۳-۱۴-۲-فهرست مواد استفاده شده برای کار ضد میکروبی
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

اندام های مختلف گیاه پروانش
ماده ضد عفونی کننده
الکل ۹۶%
سرم فیزیولوژیک
محیط کشت های مولر هینتون اگار، مولر هینتون براث
آب مقطر
گونه­ های میکروبی( Escherchia coli و Staphylococcus aureus) از آزمایشگاه میکروب شناسی دانشکده علوم- دانشگاه شیراز تهیه شد.
۳-۱۴-۳-تهیه محیط کشت میکروبی
مواد لازم برای تهیه محیط کشت مولر هینتون آگار
مولر هینتون آگار ۳۸ گرم
آب مقطر ۱ لیتر
آماده سازی محیط کشت میکروب
مقدار ۳۸ گرم از محیط کشت مولر هینتون آگار را در یک لیتر آب مقطر در ارلن ۲ لیتری ریخته و درب آن را با پنبه به طور محکم بسته و به مدت ۳ دقیقه روی شعله قرار داده تا مواد به طور یک دست در آب حل شود. سپس ارلن را درون اتوکلاو به مدت ۳ ساعت قرار داده، بعد از ۳ ساعت محلول را از اتوکلاو خارج کرده و قبل از اینکه سرد شود در پتری­دیش های که از قبل زیر نور UV گذاشته شده و درب آنها به صورت نیم باز است، ریخته شد. محلول باید تقریبا مقدار ۳/۲ از پتری دیش­ها را پر کند. بعد از مدت نیم ساعت درب پتری دیش­ها را کاملا بسته و در نایلون­های فریزری گذاشته و به صورت وارونه در یخچال قرار داده شد.
۳-۱۴-۴-کشت ۲۴ ساعته
برای تهیه کشت ۲۴ ساعته، مقدار ۲-۱ تا از تک کلنی­ها روی محیط مولر هینتون بلاد را با لوپ برداشته و به طور زیگزاک روی محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده سپس درب پتری دیش­ها را بسته و دور آن را با پارافیلم گرفته و سپس آنها در انکوباتور به مدت ۲۴ ساعت قرار داده شد. لازم به ذکر است که تمام این مراحل زیر هود و در کنار شعله کار شده است.
آماده ­سازی نمونه­های باکتری
استاندارد نیم مک فارلند
استاندارد نیم مک فارلند محلولی در تست آنتی بیوگرام است که میزان کدر بودن نمونه خود را با آن مقایسه می­کنیم .میزان کدورت این محلول معادل۱۰^۸×۵/۱ باکتری است. نحوه تهیه این محلول در آزمایشگاه به شرح زیر است:
۵/۰میلی­لیتر کلرید باریم(BaCl₂) ، ۴۸/۰مولار ( یعنی (BaCl₂.2O1.75% wt/vol به اضافه ۵/۹۹ میلی­لیتر از اسید سولفوریک ۳۶/۰ نرمال( یعنی (۱%wt/vol.
بعد از ایزوله کردن باکتری، مقداری از کلونی باکتری را به وسیله انس (نه لوپ) برداشته و در سرم فیزیولوژی استریل حل کرده، باید در نظر داشت که چون، در تست آنتی­بیوگرام میزان کدر بودن خیلی مهم است، بنابراین در انتخاب مقدار نمونه باید دقت کرد تا نمونه را بیشتر یا کمتر از نیم مک فارلند برنداشت. اگر میزان کدورت کمتر از نیم مک فارلند باشد، مقداری دیگر از نمونه را در سرم فیزیولوژی استریل حل کرده و یا اگر میزان کدر بودن، بیشتر از نیم مک فارلند باشد در این صورت باید مقداری سرم فیزیولوژی استریل اضافه کرد تا به کدورت مناسب و برابر با نیم مک فارلند رسید.
۳-۱۴-۵-تهیه عصاره آبی
اندام هوایی با آب مقطر خوب شسته و تمیز شده و به مدت یک هفته در سایه خشک شده و پس از خشک شدن با آسیاب پودر گردید. مقدار ۲۰ گرم از پودر آسیاب شده را در ۲۰۰ میلی­لیتر از آب مقطر مخلوط گردید ( غلظت ۱۰%) و در ارلن ۵۰۰ میلی لیتری ریخته و دور آن را با ورق آلومنیوم فویل گرفته و به مدت ۴۸ ساعت روی شیکر قرارداده شد. بعد از ۴۸ ساعت عصاره از کاغذ صافی رد شد و محلول به دست آمده را به وسیله آون با دمای ۴۰ درجه سانتی ­گراد و به مدت ۷۲ ساعت تغلیظ گردید. سپس عصاره به جا مانده را در یک پتری دیش خالی و استریل ریخته و در زیر هود گذاشته تا باقی مانده حلال نیز تبخیر شود و در نهایت عصاره قیری شکل بر جای ماند. مقدار ۱ گرم از ماده تقریبا خشک شده را در ۱۰ میلی­لیتر آب مقطرحل شده و در ظرف شیشه ­ای درب­دار استریل شده ریخته شده و تا زمان انجام آزماش در یخچال نگه­داری شد.
۳-۱۴-۶-تهیه عصاره هیدروالکلی
اندام هوایی برزی کاکتوس با آب مقطر خوب شسته و تمیز شده و به مدت یک هفته در سایه خشک شده و پس از خشک شدن با آسیاب پودر گردید. مقدار ۵۰ گرم از پودر آسیاب شده را در بشر ریخته سپس ml 175 الکل ۹۶% و ml75 آب مقطر به آن اضافه گردید. دور آن را با ورق آلومنیوم فویل گرفته و به مدت ۴۸ ساعت روی شیکر قرارداده شد. بعد از ۴۸ ساعت عصاره از کاغذ صافی رد شد و محلول به دست آمده را به وسیله روتاری با دمای ۴۰ درجه سانتی ­گراد و به مدت ۳۰ دقیقه تغلیظ گردید. سپس عصاره به جا مانده را در یک پتری دیش خالی و استریل ریخته و در زیر هود گذاشته تا باقی مانده حلال نیز تبخیر شود و در نهایت عصاره قیری شکل بر جای ماند. مقدار ۱ گرم از ماده تقریبا خشک شده را در ۱۰ میلی­لیتر از آب و متانول(۱/۱) و صمغ عربی حل شده و عصاره برای اطمینان از آلوده نبودن آن از فیلتر­های ۲۲/۰ نانومتری زیر هود عبور داده شد و در ظرف شیشه ­ای درب­دار استریل شده ریخته شده و تا زمان انجام آزماش در یخچال نگه­داری شد.
۳-۱۴-۷-سنجش انتشار دیسک Disc diffusion
برای انجام آزمایش های ضد میکروبی توسط روش انتشار دیسک با بهره گرفتن از استاندارد نیم مک فارلند، محلولی که میزان کدورتش معادل ۱۰^۸×۵/۱ باکتری است محلول باکتری ها را برای کشت دادن در محیط مولر هینتون آگار ( MHA ) آماده می کنیم به این صورت که از قبل یک کشت خطی از باکتری ها انجام داده، که به مدت ۲۴-۱۸ ساعت انکوبه شده سپس مقداری از کلونی باکتری را به وسیله ی لوپ استریل برداشته و در سرم فیزیولوژی استریل حل کرده تا کدورت نمونه به اندازه­ کدورت محلول نیم مک فارلند شود سپس با سوآپ استریل محلول را به هم زده و سوآپ را آب کشی کرده و آن را به محیط کشت مولر هینتون آگار انتقال داده و کشت چمنی انجام شد. بعد از کشت دیسک­های حاوی عصاره را که قبلا روی هر کدام l 15 از هر ۳ نوع عصاره را به طور جداگانه بر روی دیسک ریخته از یخچال بیرون آورد، سپس از هر کدام از عصاره ها به طور جداگانه تهیه شد و از هر کدام به مقدار l 15 روی دیسک های خام mm 4/6 ریخته شد و در یخچال گذاشته شد.
سپس دیسک ها را پس از ۳۰ دقیقه بیرون می آوریم و روی محیط کشت می­گذاریم. فاصله­ی این دیسک ها از هم حدود mm 12 است و از دیواره ی پلیت هم فاصله دارند. از ماده­ای که حلال عصاره مان است به عنوان شاهد منفی و از آنتی بیوتیک­های وانکو­مایسین و جنتا­مایسین به عنوان شاهد مثبت استفاده می کنیم. بعد از قرار دادن دیسک ها در پلیت را بسته و دور آن را با پارافیلم می­پوشانیم و در دمای c̊۳۷ انکوبه می کنیم.
بعد از ۲۴ ساعت پلیت را بررسی کردیم و قطر هاله ی عدم رشد را با خط کش اندازه گیری کردیم و با توجه به جدول همراه دیسک ها گزارش تست آنتی بیوگرام را برای هر یک از آنتی بیوتیک ها به صورت حساس ( susceptible)، مقاوم( resistance ) یا نیمه مقاوم ( intermediate ) گزارش می شود. هر سنجش در این آزمایش ۳ بار تکرار شد.
۳-۱۴-۸-انتقال میکروب به محیط کشت
بعد از تهیه محلول هموژن، با سواپ استریل محلول را به هم زده و بعد از آبکشی کردن سواپ، (برای آب کشی، سواپ را با قدرت به دیواره لوله تکیه داده و فشار دهید تا آب آن گرفته شود) آن را به محیط کشت مولر هینتون انتقال داده و به طور کامل به وسیله سواپ، محیط کشت را به صورت چمنی کشت داده شد به طوری که هیچ محلی در محیط از قلم نیافتد.
۳-۱۴-۹-آماده ­سازی دیسک­های حاوی عصاره گیاهی
مقدار ۲۰ مایکرولیتر از غلطت­های مختلف عصاره آماده شده را روی دیسک­ها به طور جدا گانه ریخته و به مدت ۲ ساعت در یخچال نگهداری شده تا عصاره به طور کامل جذب دیسک­ها شود.
نحوه قرار دادن دیسک بر روی محیط کشت میکروبی
بعد از کشت، دیسک­های آنتی­بیوگرام که نیم ساعت قبل از تست، بیرون یخچال قرار داده شده ­اند را انتخاب و بر روی محیط کشت انتقال داده شد. قابل ذکر است که نحوه قرار دادن دیسک­ها در محیط کشت مولر هینتون، به صورت دایره­ای است و فاصله این دیسک­ها از هم دیگر حدود ۱۲ میلی­متر باشد و باید از دیواره هم فاصله داشته باشند. در ضمن فاصله این دیسک­ها را می توان با توجه به تجربه خود کم و یا زیاد کرد. دیسک­های مورد استفاده هم باید با نوع باکتری ایزوله شده ما مناسب باشد مثلا هیچ وقت برای باکتری گرم منفی، پنی سیلین قرار داده نمی­ شود چون نسبت به آن مقاوم هستند و یا اینکه آنتی­بیوتیک کلروامفینیکل را برای کشت ادرار قرار نمی­گیرد چون این آنتی­بیوتیک نمی­تواند وارد مجاری ادراری شود. بعد از قرار دادن دیسک­ها، درب پلیت را بسته و به مدت ۲۴ -۱۸دردمای۳۷ درجه اینکوبیت شدند.
۳-۱۴-۱۰-نحوه خواندن و گزارش کردن
بعد از ۲۴ ساعت پلیت­ها را زیر چراغ بررسی و آنگاه می‌باید قطر هاله عدم رشد را با خط‌کش اندازه ­گیری کرد.
تجزیه و تحلیل آماری داده ها
در آزمایشهای فوق هر بستر­کشت دارای سه تیمار و هر تکرار دارای سه مشاهده بوده است.
کلیه­ داده ها با بهره گرفتن از برنامه آماری SPSS 21 به وسیله ی آزمون چند دامنه­ای دانکن و در سطح مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. جهت ترسیم نمودارها و منحنی استاندارد از برنامه Excell 2013 استفاده شد.
فصل چهارم نتایج
در این آزمایش اثر ۹ نوع بستر­کشت متفاوت بر اندام هوایی و زیر زمینی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این آزمایش در جدول­های( ۴-۱ و۴-۲ ) نشان داده شد.
۴-۱-نتایج اثر بسترهای کشت مختلف بر اندام هوایی برزی­­کاکتوس