۰.۲

۲

۰.۲

۴

۰.۲

۱۵

۰.۲

۲۰

۰.۲

۲۵

۰.۲

۵

۰.۲

۲۰

محیط ½ MS بدون هورمون

۳-۸- کشت سوسپانسیون سلولی در محیط کشت MS مایع
به منظور بررسی کشت سوسپانسیون سلولی از محیط MS مایع استفاده شد. همچنین بهترین سطح هورمونی که به منظور کالزایی استفاده شد، این بار به صورت محلول مورد استفاده قرار گرفت. محیط ½ MS با سطح هورمونی ۲,۴-D (2 میلی گرم در لیتر) و BAP (5/0 میلی گرم در لیتر) استریل شد و ۱۰ میلی گرم از محیط کشت را در ارلن های ۱۵۰ میلی لیتر توزیع نموده و کالوس­های ۶۰ روزه هیپوکوتیل، مریستم نهایی که شرایط ظاهری مناسبی از حیث رنگ و اندازه داشتند که زرد رنگ و تازه بودند به ارلن های حاوی محیط کشت به طور مساوی (از لحاظ اندازه کال ها) اضافه شد. در نهایت پس از کشت ارلن­ها در شرایط تاریکی دائم و دمای ‌۱ ۲۵ درجه سانتی‌گراد و بر روی شیکری با سرعت rpm‌۱۲۰ نگهداری شدند. پس از گذشت ۴ هفته،. طی گذشت دو هفته به منظور به دست آوردن ۵۰ میلی گرم محیط سوسپانسیون سلولی و مشاهده تغییر رنگ محیط (که نشان از جداسازی سلول های تولیدی و از هم پاشیدگی توده های کالوس بود ) هر هفته ۱۰ میلی گرم محیط کشت مورد نظر که به تازگی تهیه و استریل شده بود به ارلن اضافه شد. جداسازی سلول های تولیدی، بی نیاز از کاربرد آنزیم پکتیناز به خوبی انجام شد.
۳-۹- جداسازی ترکیبات فرار
به منظور بررسی روغن فرار گیاه روش تقطیر استفاده به عمل آمد. به عبارت دیگر با انجام عملیات اسانس گیری با دو روش تقطیر با آب و تقطیر با بخار و بررسی ترکیبات در دو روش، مقایسه ای بین نوع و میزان اجزای به دست آمده صورت گرفته است. در روش تقطیر باآب استخراج توسط دستگاه کلونجر در زمان ۱۵۰ دقیقه صورت گرفت. روش تقطیر با آب بخار نیز در طی ۱۵۰ دقیقه صورت گرفت. روغن های فرار حاصل تقطیر با هگزان نرمال استخراج و پس از آن با سولفات سدیم انیدر خشک شدند. جهت استخراج از نمونه های حاصل از کشت بافت عصاره گیری با دی کلرو متان صورت گرفت. ابتدا ۵ میلی لیتر دی کلرو متان به حدود ۱۰گرم نمونه بافت اضافه شد. مجموع حلال و نمونه پس از سابیده شدن در هاون درون لوله آزمایش قرار گرفته و توسط ورتکس به مدت ۳ دقیقه عمل جداسازی انجام پذیرفت. پس از سانتریفیوژ، فاز دی کلرو متانی توسط پیپت پاستور جدا گردید. آنگاه تا حجم ۱۰۰ میکرولیتر تغلیظ و مقدار یک میکرولیتر از آن به دستگاه GC و سپس GC/MS تزریق گرفت.
۳-۱۰- آنالیز آماری
آنالیزهای آماری با بهره گرفتن از نرم­افزار STATISTICA 10 انجام شد. قبل از انجام هر آنالیز ابتدا فرض‌های پارامتری مثل نرمال بودن و همگن بودن واریانس‌ها بررسی شدند. آنالیزهایone-way ANOVA و Factorial ANOVA جهت آنالیز واریانس استفاده شدند. نوع طرح پایه­ای استفاده شده در آزمایش­ها فاکتوریل بود. مقایسه میانگین‌ها نیز از طریق آزمون چند دامنه‌ای دانکن و رسم نمودارها از طریق نرم‌افزار Excel انجام شد. معنی‌داری در آزمون‏‏های مختلف در سطح ۰۱/۰ و ۰۵/۰ بررسی شد.

فصل چهارم
نتایج و بحث