روش­های مختلفی جهت ارزیابی فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره­های گیاهی و یا یک ترکیب خاص وجود دارد. از آن جا که عصاره­های گیاهی مخلوط پیچیده­ای از ترکیباتی با خصوصیات شیمیایی، قطبیت و گروه ­های عملکردی متفاوت می­باشند، نتایج مربوط به تعیین فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره­های گیاهی ممکن است بسته به شرایط آزمون مورد استفاده متفاوت باشند. به همین دلیل لازم است از چندین آزمون جهت تعیین دقیق میزان فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره­های گیاهی استفاده شود [۱۶۸].
برای بررسی اثر آنتی­اکسیدانی از دو روش استاندارد شامل رادیکال DPPH و قدرت احیا استفاده شد. اساس روش نخست به دام­اندازی رادیکال­های DPPH (دی فنیل پیکریل هیدرازیل) بر مبنای توانایی هیدروژن­دهی است [۱۶۹]. این روش به منظور ارزیابی فعالیت رادیکال آزاد به کار می­رود و از مزایای آن عدم وابستگی به قطبیت نمونه است [۱۷۰]. در روش دوم، قدرت احیاکنندگی مواد موجود در نمونه­ها با احیای آهن ۳ به آهن ۲ با توانایی در دادن الکترون سنجیده می­ شود [۱۶۹]. احیای آهن اغلب به عنوان شاخص فعالیت الکترون­دهی به کار می­رود که مکانیسم مهمی در عمل آنتی­اکسیدانی مواد فنلی است [۱۷۱].

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

اثر زیان­بخش رادیکال­های آزاد را می­توان توسط آنتی­اکسیدان­ها کاهش داد چون این مواد، باعث به دام انداختن و مهار تولید رادیکال­های آزاد می­شوند و از این طریق باعث پیشگیری از بیماری­های ناشی از فعالیت رادیکال­ها خواهند شد. اگرچه امروز از آنتی­اکسیدان­های سنتزی متعددی از جمله بوتیلات هیدروکسی تولوئن، بوتیلات هیدروکسی آنیزول و برخی مواد سنتزی دیگر در صنعت استفاده می­ شود اما به دلیل اثرات نامطلوب تغذیه­ای و سرطان­زا بودن این ترکیبات و نیز تمایل مصرف­ کنندگان به استفاده از ترکیبات طبیعی، استفاده از آنتی­اکسیدان­های طبیعی مورد توجه محققین قرار گرفته است [۱۷۲، ۱۷۳].
در این پژوهش جهت ارزیابی فعّالیّت آنتی­اکسیدانی عصاره­های متانولی مورد مطالعه، از آنتی­اکسیدان سنتزی اسید آسکوربیک به عنوان کنترل استفاده گردید. اسید آسکوربیک، اهمیت زیادی در ارزش غذایی میوه­ ها دارد که به دلیل اکسیداسیون نسبت به تجزیه بسیار حساس می­باشد [۱۷۴].
۴-۲-۳-۱ رادیکال­های آزاد DPPH
ترکیباتی که رنگ رادیکال آزاد DPPH را با گرفتن هیدروژن یا الکترون از ارغوانی به زرد رنگ تبدیل کنند، ترکیبات با قابلیت آنتی­اکسیدانی­اند [۱۷۵]. اندازه ­گیری میزان مهار رادیکال­های آزاد DPPH یکی از روش­های معتبر، دقیق، آسان و مقرون به صرفه با قابلیت تکرارپذیری بالایی می­باشد که در بررسی فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره­های گیاهی در شرایط آزمایشگاهی مورد استفاده قرار می­گیرد [۱۷۶]. بر این اساس، مدل به­دام­اندازی رادیکال پایدار DPPH به طور گسترده برای ارزیابی توانایی به دام­اندازی رادیکال آزاد در نمونه­های مختلف مورد استفاده قرار می­گیرد [۱۷۷].
DPPH یکی از رادیکال­های هیدروفیل آزاد و پایدار با رنگ بنفش تیره بوده که حداکثر جذب آن در محدوده ۵۱۷-۵۱۵ نانومتر است. هنگام دریافت الکترون از ترکیبات احیاکننده نظیر فنل­ها، این رادیکال به فرم هیدرازین بی­رنگ تبدیل می­ شود که این تغییر ساختار با کاهش میزان جذب همراه است [۱۷۸]. مهار رادیکال­های آزاد یکی از شناخته شده­ترین مکانیسم­هایی هستند که به واسطه آن ترکیبات آنتی­اکسیدانی می­توانند اکسیداسیون چربی­ها را مهار نمایند. در این روش، نتایج بر حسب درصد کاهش در میزان جذب محلول­های DPPH در حضور عصاره­ها نسبت به محلول DPPH فاقد عصاره بیان می­گردد [۱۷۹].
تحقیقات نشان داده است که، متانول حلال مؤثری برای تخریب دیواره سلولی و آزادسازی ترکیبات فنلی از سلول می­باشد و آنزیم پلی­فنل اکسیداز مخرب پلی­فنل­ها، در این محیط خنثی می­گردد؛ لذا عصاره متانولی گیاهان بیشترین پتانسیل مهارکنندگی رادیکال DPPH را در مقایسه با بسیاری از حلال­ها می­باشند [۱۸۰].
نتایج آنالیز واریانس نشان داد که غلظت عصاره­ها و آنتی­اکسیدان سنتزی تاثیر معنی­داری بر میزان رادیکال­های آزاد دارد. هم­چنین نتایج حاکی از آن بود که توانایی عصاره­ها در مهار رادیکال­های آزاد وابسته به غلظت بوده و با افزایش غلظت، فعالیت ضد رادیکالی افزایش می­یابد. مقایسه توانایی عصاره­های متانولی مورد مطالعه در مهار رادیکال­های آزاد DPPH در نمودار (شکل ۳-۲۲) نشان داده شده است. در محدوده غلظت ۶۲/۱۵-۸/۷ میلی­گرم بر میلی­لیتر، عصاره­ها قدرت مهارکنندگی بیشتری نسبت به اسیدآسکوربیک دارند. در سایر غلظت­های مورد بررسی، فعالیت آنتی­اکسیدانی اسیدآسکوربیک اختلاف معنی­داری با عصاره­ها دارد به استثناء غلظت ۲۵/۳۱ میلی­گرم بر میلی­لیتر که اختلاف معنی­داری بین فعالیت ضد رادیکالی اسیدآسکوربیک و عصاره متانولی گلپر و کلپوره وجود ندارد. این نتایج نشان می­دهد که در عصاره­های حاضر به جز عصاره بادام کوهی، یک غلظت بحرانی از ترکیبات فنلی برای مهار رادیکال­های آزاد کافی است. احتمالا در غلظت­های بالاتر بعضی عصاره­ها مانند کلپوره و گلپر به دلیل پیدایش نوعی حالت اشباع­شدگی، افزایش غلظت این عصاره­ها توانایی مهار رادیکال آزاد را همانند آنتی­اکسیدان سنتزی انتخابی ندارد. در عصاره بادام کوهی با افزایش غلظت عصاره میزان توانایی مهار رادیکال­های آزاد به طور چشمگیری افزایش می­یابد.
به عقیده محققین، در آزمون­های مربوط به ارزیابی فعالیت آنتی­اکسیدانی، تفاوت در فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره­های گیاهی می ­تواند مربوط به حضور نسبت­های متفاوتی از ترکیبات فنلی آب­دوست و آب­گریز در عصاره­ها باشد [۱۸۱].
علاوه بر غلظت ترکیبات فنلی، درجه گلیکوزیله بودن این ترکیبات و پارامتر مورد بررسی، از عوامل مهم در تعیین فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره­های گیاهی می­باشد [۱۸۲]. تفاوت در ویژگی­های فیزیکوشیمیایی ترکیبات فنلی موجود در هر یک از عصاره­ها دلیل دیگری در توجیه رفتار ضد رادیکالی عصاره­ها می­باشد.
تاکنون، محققین فعالیت ضد رادیکالی عصاره­های استخراج شده از منابع گیاهی مختلفی را مورد ارزیابی قرار داده­اند. در بررسی­های انجام شده، مشخص شده است گونه­ های Salvia (مریم گلی) حاوی آنتی­اکسیدان­ هستند [۱۸۳]. عصاره­های اتیل استات S. cedronell، S. adenophylla، S. napifoli، S. hedgeana، S. hydrangea، S. nygdeggrerii، S. potentillitolia، S. wiedemannii فعالیت مهار رادیکال­های DPPH را نشان داده­اند [۱۸۴]. مطالعه فیتوشیمیایی مختلف اجزاء تشکیل دهنده گیاه Achillea Millefolium L (بومادران) را مشخص نموده است اما فقط چند مطالعه ارتباط این ترکیبات را با فعالیت­های فارماکولوژیک به اثبات رسانده است [۱۸۵].
تفاوت در تعداد و موقعیت گروه ­های هیدروکسیل از ویژگی­های ساختاری مهم در تعیین ظرفیت آنتی­اکسیدانی ترکیبات فنلی می­باشد [۱۸۶]. در غلظت­های بالاتر ترکیبات فنلی به­ دلیل افزایش تعداد گروه ­های هیدروکسیل موجود در محیط واکنش، احتمال اهداء هیدروژن به رادیکال­های آزاد و به دنبال آن قدرت مهارکنندگی عصاره­ها افزایش می­یابد [۱۸۷].
قدرت و مهار عصاره­های مختلف به میزان زیادی به تعداد و موقعیت گروه ­های هیدروکسیل و وزن مولکولی ترکیبات فنلی بستگی دارد. در ترکیبات فنلی با وزن مولکولی پائین­تر، گروه ­های هیدروکسیل راحت­تر در دسترس قرار می­گیرند. علاوه بر این، ترکیبات فنلی پس از اهداء هیدروژن خود به رادیکال­های آزاد فنوکسیل تبدیل می­شوند. میزان ثبات این رادیکال­ها می ­تواند ظرفیت آنتی­اکسیدانی ترکیبات فنلی را تحت تأثیر قرار دهد چرا که رادیکال­های فنوکسیل با ثبات کمتر، با رادیکال­های DPPH در جذب اتم­های هیدروژن وارد رقابت می­شوند و بنابراین درصد به­دام اندازی رادیکال­های DPPH کاهش می­یابد [۱۸۸].
مقادیر IC₅₀ عصاره­های متانولی مورد مطالعه (غلظتی از عصاره که در آن اثر بازدارندگی اکسیداسیون برابر با ۵۰ درصد می­باشد) در نمودار (شکل ۳-۲۳) آمده است. هر چه غلظت IC₅₀ کمتر باشد نشان­دهنده فعالیت آنتی­اکسیدانی بالاتری است [۱۸۹]. در این بررسی IC₅₀ برای عصاره متانولی بادام کوهی، بومادران، کلپوره، گلپر، مریم گلی و آنتی­اکسیدان سنتزی به­ترتیب ۱۰۲/۰±۶/۴، ۱۹۵/۰±۱۷/۶، ۰۹۹/۰±۷۴/۵، ۱۵۴/۰±۰۰۵/۵، ۲۲۴/۰±۲۰۸/۶ و ۰۹۸/۰±۹۹/۳ به دست آمد. بررسی عصاره­های استخراج شده از قسمت­ های مختلف گیاهان مورد مطالعه نشان می­دهد، که این گیاهان قادر به خنثی­کردن رادیکال­های آزاد حاصل از اکسیداسیون می­باشند اما دارای IC₅₀ بیشتری نسبت به اسیدآسکوربیک می­باشند که نشان از فعالیت ضدرادیکالی بیشتر اسیدآسکوربیک نسبت به عصاره­ها دارد و عصاره­های متانولی قادر به رقابت با آنتی­اکسیدان سنتزی نمی ­باشد.
تفاوت در مقادیر IC₅₀ عصاره­های مختلف در این تحقیق را می­توان مربوط به تفاوت در مقدار و نوع ترکیبات فنلی عصاره­ها دانست. در بسیاری از پژوهش­ها، نوع حلال مورد استفاده جهت استخراج ترکیبات فنلی تاثیر قابل توجهی بر فعالیت ضد رادیکالی عصاره­های گیاهی داشته است. لیو و یائو (۲۰۰۷) گزارش کردند، عصاره استونی استخراج شده از دانه­ های جو به­علت دارا بودن مقادیر بیشتری از ترکیبات فنولی فعالیت آنتی­اکسیدانی بیشتری در مهار رادیکال­های آزاد DPPH و احیای یون­های ^۲Fe⁺ در مقایسه با عصاره­های اتانولی و متانولی داشت [۱۹۰].
۴-۲-۳-۲ قدرت احیاکنندگی
احیای آهن به عنوان معیاری برای قابلیت الکترون­دهی به کار می­رود که مکانیسم مهمی در اکسایش ترکیبات فنلی است [۹۹]. قدرت احیاکنندگی، توانایی الکترون­دهی آنتی­اکسیدان را نشان می­دهد. اگر ترکیبی این ویژگی را داشته باشد باعث کاهش ترکیبات حدواسط اکسیدشده می­ شود و به عنوان آنتی­اکسیدان اولیه و ثانویه عمل می­ کند. قدرت احیاکنندگی عصاره­های گیاهی عمدتا مربوط به حضور عوامل احیاکننده­ای است که قادرند از طریق اهدای الکترون و یا اتم هیدروژن به