• • 1. 1. تحقیقات کشت بافت بر روی گیاهان دیگر

1. 1. 1. تأثیر چهار نوع هورمون شامل، نفتالین استیک اسید (NAA)، کلروفنوکسی استیک اسید (۲,۴-D)، N⁶ (۲-ایزوپنتیل) آدنین (۲IP) و ۶ بنزیل آمینوپورین (BAP)، در محیط کشت MSبر روی کشت قسمت‌های مختلفی از گیاه گون گچی مورد مطالعه قرار گرفت. جداکشت‌ها از قسمت‌های مریستم رأسی، ساقه، برگ و ریشه از دانه‌رست‌های سترون تهیه شدند. هورمون‌های مورد استفاده BAP/2,4-D و ۲IP/NAA بود که برای هر ترکیب ۱۶ نوع تیمار با نسبت‌های مختلف بکار گرفته شد. در محیط کشت با غلظت‌های متفاوت از هورمون BAP/2,4-Dجداکشت‌های ریشه تولید کالوس‌هایی در تعداد و حجم کمتر و بدون اندام­زایی و تمایز را داشتند و سایر جداکشت‌ها به ترتیب با ترکیبات و غلظت‌های مختلف هورمونی منجر به تولید MS مریستم رأسی، ساقه و برگ در هر دو محیط کشت اندام‌های هوایی و ریشه با درصدهای متفاوت گردیدند و با توجه به آزمایش‌ها و آنالیز داده‌های حاصل مشخص شد که جداکشت‌های مریستمی بهترین جداکشت در باززایی به گیاه کامل در شرایط in vitro ترکیب هورمونی۲IP/NAA با غلظت‌های مختلف درصد کال‌زایی و اندام‌زایی بهتری را نشان داده است. در مرحله نهایی گیاهان حاصل از کشت به گلدان‌های حاوی خاک مساوی پیت و پرلیت استریل شده منتقل و با محلول هوگلند تغذیه شدند. و پس از یک هفته این گیاهان به خاک جمع آوری شده از زیستگاه اصلی خود انتقال یافتند (اربابیان و مغانلو، ۱۳۸۸).

      ( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

1. 1. مرادزاده (۱۳۸۸) اثر ترکیب و غلظت‌های مختلف هورمون‌های NAA، BAP و ۲,۴-D و کینتین را بر کالوس‌زایی و باززایی و واکنش به کشت‌بافت ریزنمونه‌های مختلف ارقام کوکر-۳۱۲، ساحل، ترمز-۱۴ و تابلادیا را مورد بررسی قرار داد. نتایج بدست آمده نشان داد که ارقام ساحل و کوکر-۳۱۲ بیشترین کالوس‌زایی را داشتند. در میان ریزنمونه‌ها نیز جنین‌نارس و محور‌زیرلپه بیشترین کالوس‌زایی را نشان دادند ولی باززایی فقط در ریزنمونه جوانه‌انتهایی مشاهده شد. بیشترین ریشه‌زایی در برگ و محور‌زیرلپه بود. در ترکیبات هورمونی، بیشترین درصد کالوس‌زایی مربوط به محیط NAA حاوی یک میلی‌گرم بر لیتر بود.

1. 1. اُیِن و همکاران (۲۰۰۵)^[۶۲] تاثیر رشد گیاهان باززایی شده را در القاء کالوس و باززایی جوانه ها درFortunei Paulownia بررسی کردند. نوک ساقه، دمبرگ، ساقه و برگ ها به عنوان نمونه در القاء کالوس در محیط کشت MS با تنظیم کننده های رشد گیاهی شاملBA ( 5 میلی گرم در لیتر و ۷ میلی گرم در لیتر) و TDZ ( 2/2 میلی گرم در لیتر و ۴/۴ میلی گرم در لیتر) یا ترکیب BA(10 میلی گرم در لیتر) و NAA ( 5/0 میلی گرم در لیتر و ۱ میلی گرم در لیتر) مورد استفاده قرار گرفت. نمونه ها در تاریکی در دمای ۲۷ درجه سانتی گراد برای ۲۸ روز قرار داده شد. بیشترین وزن کالوس مربوط به ترکیب آن بدون ریشه بود که شامل محیط کشت دارای TDZ به میزان ۴/۴ میلی گرم در لیتر بود. جوانه ها به طور مستقیم در محیط کشت دارای TDZ (4/4 میلی گرم در لیتر) بدون جنین باززایی شدند. باززایی بسیار کم در جوانه ها در محیط های دیگر در کالوس های ریشه دار (محیط دارای NAA) یا کالوس های بدون ریشه (محیط دارای BA) مشاهده شد. استفاده از محیط کشت MS با تنظیم کننده های مختلف رشد گیاهی مانند ( NAA5/0 میلی گرم در لیتر،ABA 5/2 میلی گرم در لیتر و یا ترکیبی از_۳GA 1/0 میلی گرم در لیتر و BA 2/0 میلی گرم در لیتر)، همچنین با زغال فعال ۱ میلی گرم در لیتر با محیط بدون تنظیم کننده برای بالا بردن سرعت باززایی جوانه ها مقایسه شد که مشاهده شد محیط دارای تنظیم کننده های رشد گیاهی تفاوت چندانی با محیط کشت بدون تنظیم کننده های رشد گیاهی ندارد. همچنین نشان داده شد باززایی جوانه های جانبی در مرحله القاء کالوس بستگی به غلظت و نوع تنظیم کننده های رشد دارد. بنابراین هنگامی که نمونه ها از محیط کشت دارای تنظیم کننده های رشد به محیط بدون تنظیم کننده های رشد انتقال داده شد موجب باززایی جوانه های جانبی و همچنین باعث گسترش ریشه های نرمال شد.

1. 1. رائو^[۶۳] و همکاران (۲۰۰۶) میزان کالوس‌زایی و باززایی چند رقم وحشی و زراعی پنبه را در محیط‌کشت MS حاوی انواع و غلظت‌های مختلف هورمون‌های اکسین و سیتوکنین مورد بررسی قرار دادند. این محققان محیط حاوی ۱/۰ میلی‌گرم بر لیتر NAA و ۰۱/۰ میلی‌گرم بر لیتر کینتین را مناسب‌ترین محیط جهت کالوس‌زایی و باززایی تشخیص دادند و اعلام داشتند احتمالا استفاده از غلظت‌های بالای هورمون اکسین اثر بازدارنده بر کالوس‌زایی و باززایی گیاه پنبه را به دنبال دارد. همچنین بیان داشتند که بیشترین درصد کالوس‌زایی مربوط به ریزنمونه هیپوکوتیل بود و تیپ کالوس‌های حاصل، با توجه به نوع رقم و منبع ریزنمونه متفاوت بود.

1. 1. اسلام^[۶۴] و همکاران (۲۰۱۰) باززایی (Gossypium hirsutum) از طریق کشت مریستم را به منظور تولید گیاهان ترانس‌ژنیک از طریق تکنولوژی ریزتزریق بررسی نمودند. در این مطالعه، مریستم انتهایی بر روی محیط با غلظت‌های مختلف کینتین و بنزیل‌آدنین (۶-۴-۳-۲-۱ میلی‌گرم بر لیتر) و غلظت‌های مختلف اکسین و سیتوکینین برای بررسی اثر این هورمون‌ها برای ساقه‌زایی، ریشه‌زایی و کالوس‌زایی کشت گردیدند. بهترین محیط ۲ میلی‌گرم بر لیتر بنزیل‌آدنین تنها برای ساقه‌زایی، ۲ میلی‌گرم بر لیتر کینتین + ۵/۱ میلی‌گرم بر لیتر ایندول استیک اسید برای ریشه‌زایی مناسب بودند. همچنین گزارش شد که غلظت پایین هورمون‌های گیاهی برای باززایی گیاه مناسب بودند و غلظت‌های بالای آنها سبب تشکیل ساقه‌ی غیرطبیعی و القای کالوس‌زایی می‌شود.

فصل سوم
مواد و روش ها
فصل سوم
محل انجام آزمایش
تمام مراحل آزمایش در آزمایشگاه کشت بافت گیاهی دانشگاه آزاد اسلامی واحد دامغان انجام شد.
۳-۱- مواد شیمیایی
مواد شیمیایی مورد نظر از شرکت سیگما^[۶۵] و مرک^[۶۶] تهیه شد. باید این نکته را یادآور شد تمام موارد مورد استفاده از درجه خلوص بالا برخوردار بودند.
۳-۲- تهیه بذر Foeniculum vulgare
بذرهای مورد استفاده در این پژوهش از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه گردید.
۳-۳- محیط کشت ، ترکیبات و چگونگی آماده سازی آن
یکی از مهمترین و ضروری ترین بخش های موفقیت در زمینه کشت بافت انتخاب محیط کشت مناسب است . در این آزمایش از محیط­های کشت ½ MS, MS استفاده شد.
برای تهیه محیط کشت، ابتدا محلول­های پایه را به شکل استوک یا مادری آماده کرده و در تهیه محیط کشت در زمان لازم از استوک های آماده که به طور معمول به صورت ۱۰x تهیه شده و در داخل یخچال نگهداری می­ شدند و در زمان استفاده رقیق می­شوند. محیط کشت MS شامل سه دسته مواد اصلی است:
مواد غذایی پر مصرف^[۶۷]، مواد غذایی کم مصرف^[۶۸] و ویتامین­ها. هریک از این مواد به صورت ۱۰x تهیه می­ شود و برای MS کامل استفاده شد.
۳-۴- تهیه محلول مادری MS(غلظت ۱۰X)
از محلولهای مادری تهیه شده، مقادیر زیر در یک استوانه مدرج ریخته شده و با هم مخلوط می­شوند.

۵۰ ml

Macronutrients(10x)

۲ ml

Micronutrients(100x)

۲۰ ml

MS-Vitamins(10x)

۲۰ ml

EDTA-Fe(10x)

۱۰۰۰ ml