TEMED 100%
بافر نمونه (۴X): طبق جدول ۳-۵ تهیه گردید.
محلول رنگ­آمیزی: ۰۵/۰ گرم کوماسی آبی ۲۵۰-R در ۴۰ میلی­لیتر متانول حل شد و محلول به مدت ۱ ساعت در تاریکی روی استیرر بهم خورد. سپس ۱۰ میلی­لیتر اسید استیک گلاسیال و ۵۰ میلی­لیتر آب مقطر به آن اضافه گردید. غلظت رنگ در این محلول ۰۵/۰% وزنی/ حجمی است. قبل از استفاده محلول رنگ با کاغذ واتمن صاف شد و در ظرف تیره نگهداری می­ شود.
محلول رنگ­بر: ۱۵ میلی­لیتر متانول، ۱۰ میلی­لیتر اسید استیک گلاسیال و ۷۵
میلی­لیتر آب مقطر با هم مخلوط شدند (بالا بردن نسبت متانول رنگ­بری را تسریع می­ کند. با این حال باید توجه داشت که اگر ژل مدت طولانی در محلول­هایی با درصد بالای متانول قرار گیرد، باندهای پروتئینی نیز بی­رنگ می­شوند).
۳-۳-۵-۲- آماده سازی سیستم الکتروفورز
یک قالب شیشه ­ای به کمک صفحات شیشه ­ای کاملاً تمیز و فاصله­اندازها^[۹۱] که با توجه به ضخامت مورد نیاز ژل انتخاب شده اند، ایجاد شد و با چند گیره محکم گردید. به انتهای صفحات شیشه ­ای به اندازه­ ۲/۰ سانتی­متر آگار مذاب ۵/۰% اضافه شد.
محلول ژل پایین (ژل جدا کننده): مقادیر مورد نیاز برای تهیه ژل با درصد مشخص در جدول ۳-۶ آورده شده است. پس از افزودن مواد، محلول را به سرعت بهم زده و با دقت در قالب شیشه ­ای تا ارتفاع مناسبی ریخته شد، به طوری­که حدود ۳ سانتی­متر فضا برای ژل بالا باقی ماند. سپس به آرامی از کناره شیشه روی سطح ژل اتانول اضافه گردید (این کار به منظور صاف شدن ژل و جلوگیری از چین خوردن در اثر خشک شدن به دلیل تماس هوا با آن است). انعقاد ژل پایین معمولاً ۴۵-۱۵ دقیقه طول می­کشد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

محلول ژل بالا (ژل متراکم کننده) طبق جدول ۳-۶ تهیه شد ، بعد از انعقاد ژل پایین، اتانول روی ژل پایین کاملاً خالی شد و پس از تهیه محلول ژل بالا و هم زدن آن، سریعاً تا ارتفاع مناسب روی ژل پایین ریخته شد. سپس شانه در ژل بالا قرار گرفت، به صورتی که حدود ۵/۱ سانتی­متر از سطح ژل پایین فاصله داشت. انعقاد ژل بالا حدود ۴۵-۶۰ دقیقه طول می­کشد.
پس از خارج ساختن فاصله­انداز پایین از حد فاصل شیشه­ها، قالب شیشه ­ای با چند گیره به تانک الکتروفورز متصل گردید و مخازن بالا و پایین تانک با بافر الکتروفورز پر شد (به وسیله­ یک سرنگ حباب­های هوا در حد فاصل شیشه­ها خارج شد)، سپس شانه به آرامی خارج و درون چاهک­ها با تزریق بافر الکتروفورز تمیز گردید.
برای آماده سازی نمونه­های پروتئینی، یک حجم بافر نمونه به ۳ حجم نمونه­ پروتئین حاوی ۶ تا ۲۰ میکروگرم پروتئین اضافه شد (بافر نمونه ۴x) و به مدت ۵ دقیقه در دمای ˚C 100 قرار داده شد. سپس حجم مناسبی از آن (حداکثر ۴۰ میکرولیتر) به کمک سمپلر وارد چاهک شد.
کابل­ها به الکترودهای مربوطه وصل گردید. برای الکتروفورز در جریان الکتریکی ثابت، شدت جریان ۳۰-۲۰ میلی­آمپر برای یک مینی ژل مناسب است. در صورت استفاده از ولتاژ ثابت، ولتاژ ۱۵۰-۱۰۰ ولت مناسب می­باشد. جریان برق قبل از رسیدن رنگ نشانگر به انتهای ژل قطع شد (حدود ۵/۲-۵/۱ ساعت).
بعد از قطع جریان، قالب شیشه ­ای از تانک جدا گردید و با فرو بردن یک فاصله­انداز به حد فاصل شیشه­ها و حرکت آرام آن، شیشه­ی بالا برداشته شد و سپس ژل درون یک ظرف مناسب قرار گرفت.
حجم کافی از محلول رنگ (۱۰۰ میلی­لیتر) به ژل اضافه شد.
محلول رنگ تخلیه و سپس ژل را شسته و حجم مناسبی از محلول رنگ­بر (۱۰۰ میلی­لیتر) به آن اضافه گردید. اگر زمینه­ ژل تیره بود تا شفاف شدن آن از محلول رنگ­بر تازه استفاده می­شد تا باندهای پروتئینی به وضوح دیده شوند.
ژل در محلول آبی ۷% اسید استیک قرار داده شد که ژل در این حالت برای مدت­های طولانی قابل نگهداری است.
جدول ۳-۵- نحوه تهیه بافر نمونه ۴X

ماده

مقدار

SDS

(mg) 750

تریس- HCl

(mg) 380

گلیسرول

(ml) 5/2

برموفنول بلو

(mg) 5

۲- مرکاپتواتانول

(ml) 5/2

جدول ۳-۶- نحوه تهیه ژل پلی اکریل آمید

درصد ژل

اجزاء ژل^*
بافر
محلول استوک اکریل آمید
آب مقطر
SDS ۲۰%